应用半巢式PCR检测大肠癌组织及患者粪便中bcl-2基因的重排

中华实验外科杂志 1999年第3期第16卷 大肠外科

作者：骆成玉　李世拥　祝学光

单位：骆成玉　李世拥　100700　北京军区总医院普外科；祝学光　北京医科大学人民医院外科

　　关键词： 大肠肿瘤；粪便DNA；bcl-2基因；半巢式PCR

　　【摘要】　目的　研究大肠癌中bcl-2基因重排的规律，探讨通过粪便途径的基因诊断筛查大肠癌的可行性。方法　应用半巢式PCR技术检测28例大肠癌患者癌组织及粪便中bcl-2基因重排。结果　28例大肠癌组织标本中24例(85.7%)检出bcl-2重排，粪便中检出17例bcl-2重排，其癌组织标本中bcl-2均有重排。癌组织中bcl-2基因重排在大肠癌早期即已出现，随着病程演变，这种异常表现增多趋势。结论　bcl-2基因参与大肠癌发生发展的调节，并在大肠癌细胞的增殖、进展及转移中起一定作用。存在基因异常的癌细胞的绝大多数能够通过粪便标本得以检出。bcl-2半巢式PCR灵敏、特异，具有实际应用价值。

The detection of the rearrangements of bcl-2 gene in the cancer tissues and the stool of the patients with colorectal carcinoma by semi-nest PCR

LUO Chengyu, LI Shiyong, ZHU Xueguang.

　　General Hospital of Beijing Military Command, Beijing 100700

　　【Abstract】Objective To study the regularity of the rearrangement of bcl-2 in colorectal carcinoma and probe into the feasibility of gene diagnosis screening for colorectal carcinoma by way of stool.Method The rearrangements of bcl-2 gene in the cancer tissues and the stool of 28 patients with colorectal carcinoma were analyzed by semi-nest PCR.Results The positive rate of the rearrangements of bcl-2 in cancer tissues and in the stool was 85.7% and 70.8% respectively. The rearrangement of bcl-2 had emerged in the early stage of colorectal carcinoma. With the development of the course of disease, the rearrangement of bcl-2 showed an increased tendency.Conclusions bcl-2 gene involves in the regulation of the development of colorectal carcinoma and plays a role in the proliferation, progression and metastasis of the colorectal carcinoma. Most of the cancer cells with the abnormality of gene are detectable by way of stool. The semi-nest PCR for bcl-2 is sensitive and specific, and is of a practical value.

　　【Key words】 Colorectal neoplasms Stool DNA Bcl-2 gene Semi-nest PCR

　　我们应用高敏、特异的半巢式PCR技术对大肠癌组织及患者粪便中bcl-2基因的重排进行检测，旨在研究大肠癌中bcl-2基因重排的规律，并探讨通过粪便途径的基因诊断筛查大肠癌的可行性。

　　对象与方法

　　1、一般资料　经手术病理证实的大肠癌28例，其中男13例，女15例，年龄34～74岁。手术切除后立即取小块组织液氮速冻。粪便标本在术前留取、存于-70℃。

　　2、DNA提取　(1)组织DNA^［1］：按常规酚-氯仿-异戊醇抽取基因组DNA，TE溶解，测OD₂₆₀和OD₂₈₀值定量，4 ℃存放备用。(2)粪便DNA^［2］：粪便0.5 g，加1500 μl粪便提取液，离心，10%SDS、蛋白酶K、RNA酶裂解、消化，酚∶酚/氯仿∶氯仿抽提，乙醇沉淀。

　　3、半巢式PCR　(1)引物：根据bcl-2序列及t(14∶18)断裂点集中在bcl-2基因的2个热点部位^［3］，设计两对半引物。主要断裂区(MBR)外引物C：5′-CAGCCTTGAAACATTGATGC-3′；主要断裂区内引物A：5′-TATGGTGGTTTGACCTTTAG-3′；次要断裂区(MCR)外引物D：5′-CGTGCTGGTACCACTCCTG-3′；次要断裂区内引物B：5′-GGACCTTCCTTGGTGTGTTG-3；免疫球蛋白重链基因引物JH：5′-ACCTGAGGAGACGGTGACC-3′。由于断裂点位置不同，所扩增的片断长度在200～700 bp之间不等。(2)扩增：PCR循环在PE公司PCR仪进行，反应总体积25 μl。第1轮引物用C、JH扩增MBR，D、JH扩增MCR形成的融合基因，94 ℃ 30秒、55 ℃ 35秒、72 ℃ 60秒，共35个周期；取2 μl扩增产物进行第二轮扩增，引物分别为A、JH扩增MBR，B、JH扩增MCR形成的融合基因，条件同前。取反应产物10 μl，1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴乙啶染色。

　　结果

　　1、大肠癌组织及患者粪便bcl-2重排检出情况28例大肠癌组织标本中24例(85.7%)检出bcl-2重排；粪便中检出17例bcl-2重排，其癌组织标本中bcl-2均有重排。

　　2、bcl-2基因重排与大肠癌临床病理特征见表1。

表1　bcl-2基因重排与大肠癌临床病理特征

　　讨论　　本实验建立的bcl-2半巢式PCR，引用两对半引物两轮PCR扩增。经外引物扩增的片断又经内引物扩增既增加了反应的特异性，又增加了敏感性，避免了假阳性和假阴性结果的出现。因为在第1次扩增中如果发生错配，而第2次扩增又以第1次扩增的产物作模板。此时由于模板和引物的改变，便降低了非特异性反应连续放大进行的可能性，因此错误模板再扩增的机率很小，从而可保证反应的特异性。且半巢式PCR经两次连续扩增，克服了单次扩增“平台期效应”的限制，使靶基因信息量大为增加，敏感性增加。经实验证明，结果满意，该法对于组织切片或粪便、痰液中低拷贝基因的检测意义较大。

　　本研究结果发现，癌组织中bcl-2基因重排在大肠癌早期即已出现，随着病程演变，这种异常表现增多趋势，即愈晚期重排发生比率愈见增加。提示bcl-2基因参与大肠癌发生发展的调节，并在大肠癌细胞的增殖、进展及转移中起一定作用。已证明，表达bcl-2基因的癌细胞对放疗、化疗等常规凋亡诱导剂(inducers)有明显耐受^［4，5］。晚期和转移大肠癌中bcl-2表达和重排的多见现象，可能为这种肿瘤对常规化疗药物不敏感的部分原因。因此，研究大肠癌bcl-2基因情况可用于预测治疗效果和预后，亦为大肠癌治疗设计新的抗癌药物提供了新的靶分子。

　　本研究结果表明，24例大肠癌组织bcl-2基因重排的病历中，有17例患者粪便DNA可检出bcl-2的重排(70.8%)。说明存在基因异常的癌细胞的绝大多数能够通过粪便标本检出。已知大肠癌的发生发展涉及多种癌基因的激活和抑癌基因的失活。因此，粪便DNA标本的多基因联合检测能对大肠癌的诊断提供一定帮助。

　　参考文献

　　1　Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning: Laboratory manuals, 2th ed. New York: cold spring harbor Laboratory press, 1989.

　　2　Sidransky D. Identification of ras oncogene mutations in the stool of patients with curable colorectal tumor. Science, 1992, 256:102-103.

　　3　Yuan R, Dowling P, Zucca E, et al. Detection of bcl-2/JH rearrangement in follicular and diffuse lymphoma: concordant results of peripheral blood and bone marrow analysis at diagnosis. Br J Cancer, 1993, 67:922-925.

　　4　Hsu B, Marin MC, Brisbay S, et al. Expression of bcl-2 gene confers multidrug resistance to chemotherapy-induced cell death. Cancer Bull, 1994, 46:125-129.

　　5　Fisher TC, Milner AE, Gregory CD, et al. Bcl-2 modulation of apoptosis induced by anticancer drugs: resistance to thymidylate stress is independent of classical resistance pathways. Cancer Res, 1993, 53:3321-3326.

(收稿：1998-04-17)