散发性大肠癌微卫星不稳定及hMSH2基因突变研究

中华实验外科杂志 1999年第3期第16卷 大肠外科

作者：熊斌　郑树　蔡心涵

单位：熊斌　430071　武汉，湖北医科大学附属第二医院；郑树　蔡心涵　浙江大学肿瘤研究所

　　关键词： 微卫星不稳定；大肠癌；hMSH2；基因；突变

　　【摘要】　目的　了解散发性大肠癌微卫星不稳定及其hMSH2基因突变情况。方法　用6个微卫星位点标记，PCR法检测微卫星不稳定性(microsatellite instability, MI)，银染PCR-SSCP法检测hMSH2基因5、7、8、12、13、15外显子突变。结果　60例大肠癌中，微卫星改变总的发生率为50%(30/60)；20例(33.33%)表现微卫星不稳定性，其中4例同时有杂合性缺失(loss of heterozygosity, LOH)，DNA复制错误(RER)阳性11例(18.33%)；14例(23.3%)检测到LOH。8例微卫星不稳定性大肠癌组织检测到第5外显子杂合性突变，而未发现胚系突变。结论　散发性大肠癌中微卫星不稳定是一个常见的分子事件，与hMSH2基因胚系突变无关，可能为体细胞性突变或/和缺失所致。

Study on microsatellite instability and hMSH2 gene mutation in sporadic colorectal cancer

XIONG Bin, ZHENG Shu, CAI Xinhan.

　　Cancer Institute, Department of General Surgery, The Second Affiliated Hospital of Hubei Medical University, Wuhan 430071

　　【Abstract】Objective To study the microsatellite instability (MI) and hMSH2 gene mutation in sporadic colorectal cancer.Method MI was detected by using D2S123, D2S119,D13S160, D8S282, D3S1293 and D18S58 microsatellite markers. Silver staining PCR-SSCP method was used to detect mutation of hMSH2 gene exons 5, 7, 8, 12, 13, 15 in the MI cases.Results Among the 60 cases, 33.3% of the cases showed MI, 18.3% of the cases RER positive, 23.3% of the cases loss of heterozygosity. hMSH2-somatic heterozygosity mutation was found on the exon 5 in sporadic colorectal cancer tissues in 8 MI cases.Conclosions MI phenotype might be present ubiquitously in sporadic colorectal cancer in China. Its positive ratio was consistent with that of other reports. Germ-line mutation of hMSH2 was not related with the occurrence of MI in sporadic colorectal cancer. The sporadic colorectal cancer with MI might have alterations of unknown genes related to the mismatch repair system.

　　【Key words】 Microsatellite instability Colorectal cancer hMSH2 Gene Mutation

　　我们对60例散发性大肠癌组织的微卫星不稳定性进行研究，结合临床病理资料，探讨其临床意义，并研究微卫星不稳定性散发大肠癌hMSH2突变。

　　材料和方法

　　1、标本收集和基因组DNA提取　经病理证实的大肠癌60例，其中男37例，女23例，年龄32～78岁，平均56岁。标本随机取自浙江医科大学附二医院1996年3月～1997年5月间的手术新鲜组织，基因组DNA提取采用蛋白酶K消化，酚-氯仿抽提法。

　　2、微卫星不稳定性检测　选用D2S119、D13S160、D8S282、D3S1293、D2S123和D18S58六个微卫星位点进行检测。PCR反应体系为50 mmol/L KCl，10 mmol/L Tris-Cl, 0.1%Trito X-100, 1.5 mmol/L MgCl₂，200 μmol/L dNTPS，模板DNA 200 ng，上下游引物各50 pmol,Taq酶1 U，加去离子水至50 μl。PCR反应参数为：94 ℃变性5分钟，然后进入35个循环(94 ℃45秒，退火温度30秒，72 ℃1分钟)，最后70 ℃延伸10分钟，4 ℃保存。PCR产物用8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后进行银染。

　　3、PCR-SSCP法检测hMSH2基因突变　PCR反应体系和PCR反应参数同前。PCR产物用8%中性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后进行银染。

　　4、序列分析证实PCR-SSCP法检测结果　用PGEM-T质粒载体将PCR产物进行克隆(TA克隆)，然后以M13为引物用自动序列分析仪测序。

　　结果

　　1、MI和LOH发生率　60例标本中，20例(33.33%)表现微卫星不稳定性，RER阳性11例(18.33%)，在14例(23.3%)中检测到LOH。六个位点中，微卫星不稳定性发生率依次为：D3S1293 18%(11/60)，D2S123 13%(8/60)，D8S282 13%(8/60)，D18S58 12%(7/60)，D2S119 12%(7/60)，D13S160 7%(4/60)；LOH发生率依次为：D2S123 10%(6/60)，D18S58 8%(5/60)，D3S1293 7%(4/60)，D8S282 7%(4/60)，仅1例在D2S119位点有LOH，D13S160未检测到LOH。

　　2、RER阳性大肠癌的临床和病理特征　60例大肠癌中，发现RER阳性11例，年龄32～78岁，平均52岁；RER阴性49例，年龄34～78岁，平均57岁，RER阳性组比RER阴性组平均发病年龄小(P=0.18)。6例40岁以下的大肠癌中，RER阳性占3例(50%)；54例40岁以上的病例中，RER阳性8例(14.8%，P＜0.05)。11例RER阳性大肠癌中，4例一级亲属有恶性肿瘤病史，49例RER阴性病例中，也有4例一级亲属有恶性肿瘤病史，RER阳性病例有恶性肿瘤家族史的比例明显高于RER阴性(8.2%，P＜0.05)。11例RER阳性病例中，1例曾患大肠癌，而RER阴性无1例有恶性肿瘤病史。1例RER阳性病例为多原发性大肠癌，升结肠内同时有两个肿瘤，均为RER阳性，RER阴性病例无多原发癌患者。RER阳性大肠癌与RER阴性大肠癌比较，在肿瘤部位、生长方式、Dukes分期等方面有一些差别，但无统计学意义。

　　3、肿瘤组织hMSH2基因突变　在20例微卫星不稳定性大肠癌中检测hMSH2基因5、7、8、12、13、15外显子突变，发现8例在第5外显子存在杂合型突变，其中1例在第7外显子发现另一突变，相应粘膜未发现突变条带，因此，该突变为体细胞性突变。

　　4、序列分析　将PCR-SSCP检测有突变、可疑突变和正常的标本各一对，再次PCR扩增，扩增产物克隆后序列分析，证实5号标本肿瘤组织在410号密码子T→C置换，5号标本正常粘膜无这种改变，可疑突变和无突变者也无这种改变。

　　讨论

　　本组60例大肠癌中，MI的检出率为33.33%，RER阳性率为18.33%，介于文献报道的12%～40%之间。我们对本研究中RER阳性与RER阴性大肠癌的临床病理资料进行比较，发现RER阳性组发病平均年龄52岁，比RER阴性组57岁小，不同年龄组比较，年龄组越小，RER阳性率越高，61岁以上组22例仅1例阳性，41～60岁组32例中有7例阳性，40岁以下组阳性率最高，6例中有3例RER阳性，明显高于40岁以上组的阳性率；RER阳性大肠癌易发生肠内多原发性恶性肿瘤，本组仅2例RER阳性病例患大肠内重复癌；说明RER阳性大肠癌与RER阴性大肠癌的发病机制不同，提示青年人大肠癌与老年人大肠癌在发病机制上可能存在差异。青年人大肠癌是倾向于遗传上的改变而引起一系列癌基因和/或抑癌基因失活，最终引起细胞恶性转化，发生肿瘤。本组60例大肠癌中，LOH的检出率为23.3%，除D13S160位点外，其它5个位点在不同病例均检测到MI和LOH，4例在不同位点同时检测到MI和LOH，说明MI和LOH在某些大肠癌的发生发展中起重要作用。HNPCC的发生与错配修复基因的突变密切相关。已知的5个错配修复基因中，hMSH2和hMLH1基因突变较多见。许多研究发现，hMSH2基因突变主要散布在5、7、8、12、13、15号外显子^［1］。本研究检测出的20例微卫星不稳定性大肠癌，用PCR-SSCP法重点研究了hMSH2基因的5、7、8、12、13、15号外显子突变；研究发现8例存在hMSH2基因体细胞性杂合型突变，未发现胚系突变。最近研究发现，hMSH2一个野生型等位基因编码的产物足以维持其整个基因的功能，两个等位基因同时突变和/或缺失才能使基因失活而丧失其功能^［2］。从本研究可得出如下结论：微卫星不稳定性“散发性”大肠癌的发生与hMSH2基因的胚系突变无关，可能为体细胞性突变所致；hMSH2基因的突变较少，它在微卫星不稳定性“散发性”大肠癌发生发展中的作用有限，可能有其它错配修复相关基因改变，尚需进一步研究。

　　本课题为国家九五攻关资助项目(No.96-906-01-21)

　　参考文献

　　1　熊斌，郑树.错配修复基因与肿瘤.国外医学肿瘤学分册.1997，24：16-18.

　　2　Liu B, Farrington SM, Petersen GM, et al. Genetic instability occurs in the majority of young patients with colorectal cancer. Nature Medicine, 1995, 1:348-352.

(收稿：1998-12-18)