白血病细胞p53和bcl-2表达与化疗药物诱导凋亡的关系

　　中华内科杂志2000年第39卷第3期

史剑慧　许小平　程文英　罗伟华　王健民　丁训杰

　　摘要　目的：探索p53和bcl-2表达及化疗药物体外诱导白血病细胞凋亡与患者化疗疗效的关系。方法：用免疫组化法测定42例急性白血病患者骨髓细胞p53和bcl-2表达水平；用TdT介导的脱氧核苷酸切口和末端标记法（Tunel法）、Wright-Giemsa染色及超微结构观察等方法检测化疗药物诱导的白血病细胞凋亡。结果：42例急性白血病患者p53和 bcl-2 总体表达水平显著高于对照组。27例随访组患者完全缓解(CR) 16例,未缓解(NR)11例。CR者表现以p53和bcl-2共同阴性及化疗诱导高凋亡为主, NR者以p53和bcl-2共同阳性及化疗诱导低凋亡占优势。形态学观察可见典型细胞凋亡特征。结论：检测急性白血病患者p53和bcl-2表达水平及体外化疗药物诱导白血病细胞凋亡的敏感性有助于预测患者的化疗效果。

　　关键词：白血病, 非淋巴细胞，急性　白血病，淋巴细胞，急性　基因，p53　脱噬作用　bcl-2基因

　　国内外众多的研究表明,恶性肿瘤的发生、发展及预后与凋亡密切相关。大部分抗肿瘤药物的作用机制是诱导肿瘤细胞凋亡,部分肿瘤细胞对化疗产生耐受，可能与细胞内某些与凋亡相关的基因表达改变存在着一定的关系。目前，已知野生型p53和bcl-2基因分别是血液系统恶性肿瘤中最为重要的凋亡诱导和拮抗相关基因^［1］。为了探索急性白血病患者p53、bcl-2表达与化疗药物诱导白血病细胞凋亡的关系，我们共采集了42例急性白血病患者的骨髓细胞，用免疫组化法检测了p53和bcl-2表达水平，用TdT介导脱氧核苷酸切口和末端标记法(Tunel法) 、Wright-Giemsa染色及超微结构观察等方法比较研究了数种化疗药物体外诱导白血病细胞凋亡的作用，并结合临床资料进行分析。目的是为急性白血病化疗效果预测建立一项敏感实用的指标。

　　资料与方法

　　1.病例和标本：42例初诊急性白血病患者来自第二军医大学长海医院血液科和上海医科大学华山医院血液科。随访组27例，其中男14例，女13例,年龄14～70岁，中位年龄44岁；急性非淋巴细胞白血病（ANLL） 18例，急性淋巴细胞白血病（ALL） 9例。失随访组15例，其中ANLL 9例，ALL 6例。以上所有患者均经形态学、细胞化学及免疫组化确诊。另有10例血液系统良性疾病（特发性血小板减少性紫癜6例，缺铁性贫血4例）患者作为对照。初诊时抽取新鲜骨髓, 抗凝。用分离液分离单个核细胞,制备细胞悬液及离心涂片。

　　2.化疗方法： 随访组的27例急性白血病患者按FAB分型计ANLL 18例，其中M₁ 1例、M₂ 9例、M₃ 1例、M₄ 4例、M₅ 2例、M₇ 1例；ALL 9例。ANLL治疗采用HA（高三尖杉酯碱、阿糖胞苷）、DA（柔红霉素、阿糖胞苷）方案。其中1例M₃和1例伴早幼粒细胞显著增高的M₂患者，确诊后因曾分别服用过全反式维甲酸（ATRA）1周和4周，故化疗前重新抽取骨髓细胞作p53、bcl-2表达及化疗药物诱导凋亡的检测。ALL采用VDCP（长春新碱、柔红霉素、环磷酰胺、泼尼松）或VDP（长春新碱、柔红霉素、泼尼松）方案治疗。完全缓解（CR）与未缓解（NR）疗效判别按国内现行标准。

　　3.白血病细胞p53和bcl-2表达检测：所用单抗p53 （DO-7）和bcl-2（124）购自上海华美公司（系丹麦DAKO公司产品）。即用型HRP-DAB药盒购自美国Labvision公司。以L-多聚赖氨酸（上海华美公司）预先涂布玻片。细胞涂片（细胞浓度为2×10⁶/ml）后丙酮固定，过氧化氢作用后微波抗原修复。用正常血清短暂作用后加p53和bcl-2单抗，37℃湿盒作用30 min,加生物素化二抗室温作用10 min,加辣根酶标记链霉亲和素工作液（streptavidin/HRP）室温作用10 min,最后以DAB染色。细胞核（p53）或细胞浆（bcl-2）被染成黄棕色为阳性细胞。计数1 000个细胞中的阳性细胞，并以白血病细胞比例值作校正。

　　4.化疗药物体外诱导白血病细胞凋亡：单个核细胞浓度为1×10⁶/ml, 分别孵育于(1) 高三尖杉酯碱(H)2 mg/L, (2) 柔红霉素(D)1.0 μmol/L， (3) 阿糖胞苷(A) 1.0 μmol/L， (4) H(2 mg/L) +A(1.0 μmol/L)， (5) D(1.0 μmol/L)+A(1.0 μmol/L)， (6) 环磷酰胺(C) 10 μmol/L， (7) 氟美松(DXM) 10 μmol/L,作用18 h。

　　5.凋亡检测：(1) Wright-Giemsa染色法: 细胞离心涂片染色,光镜下计数具有明显凋亡特征的细胞(细胞缩小, 核染色质凝聚,核碎裂等)。(2) Tunel法检测片段化DNA:主要步骤为1%甲醛固定细胞,以Triton X-100穿透细胞,洗涤后滴片, 晾干。用dUTP-荧光素标记Kit购自德国保灵曼公司上海分公司)进行温育反应, 每一标本均设立阴性对照, 即不加关键的TdT酶。然后加抗荧光素-AP, 再加底物(BCIP＋NBT)将基于荧光素的Tunel检测转化为显色法。阳性细胞被染成蓝黑色。计数1 000个细胞中阳性细胞数并以骨髓分离后白血病细胞比例作校正。(3) 透射电镜标本制备: 细胞以PBS洗涤后,用戊二醛和OSO₄固定后漂洗、脱水、包埋、超薄切片，染色，晾干后以透射电镜观察细胞内超微结构。

　　6.统计学分析：实验数据分析采用两样本率均数比较的χ²检验。

　　结果

　　1.急性白血病患者p53及bcl-2表达水平:见表1。从表1结果提示ANLL和ALL患者化疗前白血病细胞的p53和bcl-2表达均较对照组明显增高。

　　　　　表1　急性白血病患者骨髓细胞p53 及bcl-2表达水平（%，x±s）

注：与对照组相比^*P＜0.05

　　2.化疗药物体外诱导白血病细胞凋亡结果: 见表2。从表2结果表明, CR患者,除Wright-Giemsa法检测的环磷酰胺诱导组及Tunel法检测的DXM诱导组外，化疗前白血病细胞体外对化疗药物的敏感性均高于NR患者（P值均＜0.05）。在所有的实验组中Tunel法的敏感性普遍要高于Wright-Giemsa法。图1为Tunel法检测1例ALL患者化疗前白血病细胞体外对柔红霉素诱导凋亡的敏感性。

　　　　表2　急性白血病患者化疗前体外不同化疗药物诱导白血病细胞凋亡率（%,x±s）

　　 注:ANLL CR组11例,NR 组7例;ALL CR组5例,NR组4例;CR组与NR组比较^*P＜0.05,^**P＜0.01　　3.白血病细胞p53、bcl-2表达与体外化疗药物诱导凋亡的关系: 将体外化疗药物诱导细胞凋亡的百分率以35%(Tunel法)为界,小于此限为低凋亡, 大于等于此限为高凋亡,而基因表达水平则以10%(p53)和15%(bcl-2)为界,小于此限,为p53和bcl-2阴性,大于等于此限为p53和bcl-2阳性。p53和bcl-2表达水平与化疗药物诱导白血病细胞凋亡的关系，见表3。

　　　　表3　急性白血病患者p53、bcl-2表达与体外化疗药物诱导凋亡的关系

　　 注:p53阳性23例,高凋亡者10例(43.5%),阴性者19例,高凋亡8例(42.1%),两者无明显差异;而bcl-2阳性31例中高凋亡仅7例(22.6%),11例阴性者全部为高凋亡,两者比较P=7.43×10^-6,差异有极显著意义

　　从表3结果显示31例bcl-2阳性患者，无论p53表达是否阳性，有24例患者体外诱导为低凋亡，而bcl-2阴性的11例患者，无论p53表达是否阳性，均为高凋亡。提示体外化疗药物诱导白血病细胞凋亡的敏感性主要取决于bcl-2表达状态。

　　4.白血病细胞p53、bcl-2表达及体外化疗药物诱导凋亡与临床疗效关系:见表4。

　　　　表4　27例随访白血病细胞p53、bcl-2表达及体外诱导凋亡与临床疗效关系

　　 表4所示为27例随访急性白血病患者白血病细胞p53、bcl-2表达及体外诱导凋亡与临床化疗的关系。体外化疗诱导为高凋亡者共15 例，其中13 例均获得CR(86.7%)，而体外化疗诱导为低凋亡的12例，仅3例获CR(25.0%),两者比较χ²＝8.102,P＜0.01。

　　5. 形态学变化: 经化疗药物作用的白血病细胞在光镜下出现典型的凋亡形态特征，即细胞体积缩小、核固缩、染色质凝集，并有凋亡小体形成。电镜下观察，胞质空泡化，各种细胞器均出现不同程度的萎缩，胞膜尚完整，核固缩、碎裂，凋亡小体易见。讨论

　　目前认为，化疗药物诱导白血病细胞凋亡是使患者临床获得完全缓解的主要机制所在。分子生物学的研究证明凋亡过程涉及一系列调控细胞增殖及存活基因的表达改变，其中以野生型p53和bcl-2基因的作用尤为重要^［2,3］。野生型p53基因的表达产物作为转录因子可以调控与细胞增殖有关的基因，阻止G₀/G₁期细胞进入S期，诱导白血病细胞凋亡；而突变型p53因丧失其对凋亡的诱导作用而导致白血病细胞的耐药^［4］。Wattel等^［5］分析了白血病患者p53突变与化疗预后的关系，一组ANLL患者中p53突变者仅有33.0％获得CR，而无p53突变者CR率为81.0％；在慢性淋巴细胞白血病（CLL）组，有 p53突变者化疗CR率为12.5％，而非突变者为80.0％。由于野生型p53的半衰期仅为数分钟,而突变的p53则半衰期明显延长，故采用免疫组化方法检测阳性的p53，相当于突变型p53^［6］。

　　bcl-2基因是一重要的凋亡抑制基因。体外实验显示，bcl-2表达增强可使白血病细胞抵抗糖皮质激素、柔红霉素、阿糖胞苷及VP16等化疗药物诱导的凋亡。各种类型的急性白血病bcl-2表达都有不同程度的增强^［7,8］。Campos等^［9］发现ANLL患者化疗前bcl-2表达阳性细胞数量与化疗效果有显著相关性。Uckun等^［10］在研究了388名儿童ALL患者bcl-2表达后发现，在T-ALL中bcl-2高表达者治疗28d仍不能达到CR。我们对42例初发急性白血病的检测结果表明，化疗前急性白血病患者骨髓细胞的p53和bcl-2表达均显著高于对照，提示p53的突变和bcl-2的表达增强与急性白血病的发病有密切关系。通过对27例随访组患者的观察还发现患者化疗前p53、bcl-2表达水平与化疗预后存在着一定的联系。p53、bcl-2共同阳性的患者，化疗效果差，而p53、bcl-2共同阴性者CR率高，且bcl-2阳性似比p53阳性的意义更为重要。

图1　Tunel法检测化疗药物体外诱导急性淋巴细胞白血病患者细胞凋亡。

　　图中深染细胞为Tunel阳性细胞　×400

　　为了探索临床采用的化疗方案对急性白血病患者诱导凋亡的敏感性，我们对所有随访组患者化疗前的骨髓白血病细胞进行体外诱导凋亡的研究，并结合临床疗效进行分析。结果表明，体外诱导凋亡敏感性高的化疗药物，临床应用后大多能使患者获得CR，两者之间具有较好的一致性。这里，值得提及的是2例化疗前曾服用过ATRA的患者，在初诊时白血病细胞均为p53阴性、bcl-2阳性，体外化疗药物诱导为低凋亡，但服用ATRA后再次检测，bcl-2表达转为阴性，化疗药物诱导结果为高凋亡，其机制可能与ATRA能下调bcl-2表达有关^［11］。我们的结果还表明，Tunel法用于骨髓白血病细胞的检测，具有快速简便及可作定量分析的优点，尤其适合于临床应用。但因本研究的观察仅限于初治的急性白血病患者，对于难治与复发患者是否亦有同样的应用价值，目前，我们仍在进一步研究之中。

　　基金项目：上海市科技发展基金资助项目(944512006)

　　作者单位：史剑慧（上海医科大学放射医学研究所　200032)

　　 　程文英（上海医科大学放射医学研究所　200032)

　　 　罗伟华（上海医科大学放射医学研究所　200032)

　　 　许小平、王健民（第二军医大学长海医院血液科)

　　 　丁训杰（上海医科大学华山医院血液学研究室）

　　参考文献

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