抗癌药物对乳腺癌细胞动力学及凋亡基因Bcl-2/Bax的影响

中华实验外科杂志 1999年第2期第16卷 论　著

作者：宋振川　吴祥德　王桂兰　　耿翠芝

单位：050011　石家庄，河北医科大学附属第四医院外一科

　　关键词： 乳腺癌；细胞凋亡；Bcl-2/Bax基因；抗癌药物；流式细胞术

　　【摘要】　目的　探讨抗癌药物对乳腺癌细胞动力学及凋亡基因Bcl-2/Bax的影响。方法　用流式细胞术测定乳腺癌细胞核DNA含量(DI)、S期细胞比率(SPF)、细胞凋亡指数(AI)、凋亡基因Bcl-2、Bax的表达及雌激素受体(ER)等进行定量分析。结果　①用药组与对照组相比，DI、SPF及Bax明显低于对照组(P＜0.01)，而AI(P＜0.05)、Bcl-2(P＜0.001)则高于对照组，ER于两组间无统计学差异；②AI与SPF、Bcl-2及ER的表达均呈正相关，而与Bax无明显相关关系。结论　抗癌药物主要通过细胞凋亡而发挥作用，用药后的生物学指标可表现为AI及Bcl-2升高，SPF、DI值及Bax下降；AI与SPF、Bcl-2及ER均呈正相关。根据这些指标可判定药物的疗效，并可用于预后的预测。

　　Effect of anticancer-drugs on primary breast cancer cell kinetics and apoptosis genes bcl-2/Bax protein expression　SONG Zhenchuan, WU Xiangde, WANG Guilan, et al. Department of Surgery, The Fourth Affiliated Hospital, Hebei Medical University, Shijiangzhuang 050011

　　 　　【Abstract】　Objective　To study the effect of anticancer-drugs on primary breast cancer cell kinetics and apoptosis genes Bcl-2/Bax protein expression. Method　Kinetic targets DNA index (DI) and S-phase fraction (SPF), apoptosis genes Bcl-2/Bax expression, apoptotic index (AI) and estrogen receptor (ER) were examined by using flow cytometry in the primary breast cancer patients with or without pre-chemotherapy. Result　As compared with control group, a significant decrease in DI (P＜0.001)， SPE (P＜0.001)， and Bax protein expression (P＜0.001) was found, but AI (0.05＞P＞0.01) and Bcl-2 protein expression (P＜0.001) displayed a significant increase in pre-chemotherapy group. No significant difference in ER was found between the two groups. High percentage of AI was positively correlated with high percentage of SPF, high expression of Bcl-2 and ER protein. But Bax showed no relation with AI. Conclusion　The anticancer-drugs gave their effects by inducing cancer cell apoptosis. The above parameters can be used to judge the anticancer-drugs efficiencies and to predict prognosis.

　　 　　【Key words】　Breast carcinoma　　Cell apoptosis　　Bcl-2/Bax genes　　Anticancer-drugs　　Flow cytometry

　　我们应用流式细胞术（FCM）测定乳腺癌病人细胞动力学指标DNA含量(DI)、S期细胞比率(SPF)，细胞凋亡指数(AI)，凋亡基因Bcl-2、Bax的表达及雌激素受体(ER)等进行定量分析，以其作为判断化疗药物效果的依据。

　　对象与方法

　　一、一般资料

　　选择我院外科1997年11月～1998年3月女性乳腺癌住院病人60例，年龄35～90岁，中位年龄50.3岁，术前经针吸细胞学或冰冻病理切片证实为乳腺癌。随机分成两组，每组30例。对照组术前不用药而直接手术，实验组术前1～2周给予CMF方案化疗1～2次，其中每次氟脲嘧啶500mg/m²，甲氨喋呤30mg/m²，环磷酰胺400mg/m²，静脉滴注。两组病人均行手术治疗，术后取新鲜癌组织标本3～5g，70%酒精固定后送检。

　　二、流式细胞仪(FCM)分析

　　1. Bcl-2、Bax及ER的样品制备　取手术切下的新鲜瘤组织0.5g左右，将组织置于铜网上，剪碎，铜网下接一容器，用镊子将组织轻搓，边搓边用PBS缓冲液冲洗，收集冲洗下来的悬液。经160～180目尼龙网过滤。以1000转/分速度离心两次，每次1～2分钟，弃上清。加入1mlPBS将其悬浮，并计数调整细胞为每毫升1×10⁶个。取瘤细胞悬液0.1ml,分别加入0.1ml工作液浓度的Bcl-2、Bax或ER单克隆抗体混匀，置室温30分钟。加入PBS缓冲液10ml混匀，离心1000转/分，5分钟，弃上清。Bcl-2、Bax加入FITC-羊抗鼠(ER加羊抗兔)IgG工作液0.1ml，室温孵育30分钟，避光。加入1mlPBS混匀，经300目铜网过滤主样品器中即可上机检测。

　　2. PCD的样品制备　如上法制备单细胞悬液，加入0.5%胃旦白酶2ml,37℃水浴20～30分钟，同时振荡悬浮1～2次，加PBS液10ml终止消化。1000转/分离心2分钟，弃上清。加EB染液1～2ml,30分钟后上机检测。

　　3. 流式细胞术测量方法　采用美国BD公司生产的流式细胞仪FACS420型激发光源为2W氩离子激光器，输出功率300mW。FITC和EB两种荧光染料具有相同的激发光谱，可采用一个激发波长为488nm的长通滤光片用于荧光的探测。测量的数据和图形输入HP-300Consort30计算机，应用相应的程序进行资料处理。

　　三、统计学方法

　　数据均以均数±标准差(±s)表示，其检验方法采用t检验，两个变量间的相关关系采用直线相关分析。

　　结　果

　　一、用药组和对照组的DI、SPF、AI、Bcl-2、Bax及ER的相对含量如表1。

　　表1　两组DI、SPF、AI、Bcl-2、Bax及ER含量的比较

　　二、AI与SPF、Bcl-2、Bax及ER的关系

　　AI与SPF、Bcl-2及ER均呈正相关(P＜0.05)。而与Bax关系不明显(P＞0.05)，无统计学意义。讨　论

　　本研究结果发现，用药组较对照组AI值明显升高(P＜0.05)，而DI、SPF则下降(P＜0.001)。这充分说明用药前肿瘤增殖活性高，肿瘤细胞生长旺盛，即DI、SPF值较高，当抗癌药物作用于肿瘤细胞后，增殖活性较高的细胞首先出现凋亡，而使临床所测用药组的AI值高于对照组，由于增殖活性高的细胞在药物的诱导下大部分发生了凋亡，也就造成了临床上的用药后DI、SPF明显低于用药前的结果，即SPF越高，发生凋亡的机会越多。

　　本实验结果发现用药组较对照组Bcl-2明显升高，而Bax明显下降，这是因为用药后Bcl-2与肿瘤分级、有丝分裂指数、Ki-67指数、肿瘤大小呈负相关^［1］，而Bax与肿瘤分级、肿瘤增殖活性呈正相关^［2］。用药后组织分级高、增殖活性高的细胞出现凋亡，致使组织分级低、增殖活性亦低的细胞聚集，表现出Bcl-2升高，Bax表达水平降低。从而说明，如果某种药物有效，诱导凋亡明显，则Bcl-2的升高及Bax的降低亦明显。同时本实验还发现ER高表达与AI呈正相关(P＜0.05)，表明ER表达水平高的癌细胞易于发生凋亡。

　　综上所述，抗癌药物主要通过细胞凋亡而发挥作用，用药后的生物学指标可表现为AI及Bcl-2升高，SPF、DI及Bax值下降，AI与SPF，Bcl-2及ER均呈正相关。根据这些指标可判定药物的疗效，凋亡指数AI及SPF，DI的测定可作为判定某种化疗药物疗效的重要生物学指标，Bcl-2及Bax的表达水平作为判定药效的参考，用药后AI、Bcl-2升高，DI、SPF及Bax值下降，说明此种药物效果好。对术前化疗病人测定以上生物学指标，也可用于判定预后，如果AI、Bcl-2、ER较高，SPF、DI及Bax值低，则可能有较好的预后。

　　本课题为河北省卫生厅资助项目(No.98004)

　　 参考文献

　　1　Slooten HJ, Clahsen PC, Dierendonck JH, et al. Expression of Bcl-2 in node-negative breast cancer is associated with various prognostic factors, but does not predict response to one course of perioperative chemotherapy. Br J Cancer, 1996,74：78-85.

　　2　Binder C, Marx D, Binder L, et al. Expression of bax in relation to bcl-2 and other predictive parameters in breast cancer. Ann-Oncol, 1996,7:129-133.

(收稿： 1998-07-27　修回： 1998-09-23)