宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16型L1基因的克隆及序列分析

中华实验和临床病毒学杂志 1999年第1期第0卷 论著

作者：谷鸿喜　凌虹　张凤民　钟照华　王文阁　郭淑元　娄阁　郭彩玲

单位：150086　哈尔滨医科大学微生物学教研室(谷鸿喜　凌虹　张凤民　钟照华　郭淑元　郭彩玲)；中国军事医学科学院二所三室(王文阁)；哈尔滨医科大学附属三院妇科(娄阁)

　　关键词： 人乳头瘤病毒16型；L1基因克隆；核苷酸序列测定

　　【摘要】　目的　人乳头瘤病毒16型(HPV16)晚期基因区(L1)编码病毒的主要衣壳蛋白，且HPV16感染与宫颈癌发生、发展关系密切，故对中国妇女感染的HPV16基因进行克隆及序列分析有重要实际意义。方法　采用聚合酶链反应技术(PCR)扩增了3例中国妇女宫颈癌组织中HPV16的L1基因片段，并对其进行了克隆及全序列分析。结果　发现3个HPV16 L1基因核苷酸序列有4处均与最初报道的HPV16 L1 DNA序列不同，并由此引起所编码的氨基酸亦发生变化。结论　中国妇女宫颈癌组织中HPV16 L1核苷酸有一定程度变异。

　　Cloning and sequencing of human papillomavirus 16 L1 gene from cervical carcinoma tissues of Chinese women　GU Hongxi, LING Hong, ZHANG Fengmin, et al. Department of Microbiology, Haerbin Medical University, Haerbin 150086

　　【Abstract】　Objective　Human papillimavirus type 16 (HPV16) is highly related with the development of cervical carcinoma. HPV16 late gene L1 encodes its main capsid protein. This study is to analyze the whole sequence of L1 gene of HPV16 of the Chinese isolates.Methods　Three samples of HPV16 L1 gene were amplified from cervical carcinoma tissues of Chinese patients by PCR and then cloned and sequenced.Results　There were four sites in nucleic acid sequences of all three HPV16 L1 fragments were different from the originally reported sequence of HPV16 and the differed sequences had changed the triplet codes, therefore, subsequenely changed the amino acids it coded.Conclusion　The results showed that some mutation had taken place in the nucleotide sequence of L1 gene of HPV16 obtained from the cervical carcinoma tissues of Chinese women.

　　【Key words】　　　Human papillomavirus type16　　L1 Gene cloning　　DNA sequencing

　　诸多研究表明，人乳头瘤病毒16型(Human papillomavirus type 16, HPV16)与宫颈癌的发生、发展密切相关^［1］。HPV基因功能区主要由早期基因区(E区)、晚期基因区(L区)和调节区组成，L区包括L1和L2。L1晚期基因编码病毒的主要衣壳蛋白^［2］，该蛋白能刺激机体产生保护性抗体^［3］，为此对该基因的克隆在制备基因工程疫苗等方面有很大的实际意义。为了对中国妇女感染的HPV16 L1基因序列进行分析，我们采用PCR法扩增了3例中国妇女宫颈癌组织中感染的HPV16 L1基因片段，并对其进行了克隆及测序分析。

　　1　材料和方法

　　1.1　宫颈癌组织　采自哈尔滨医科大学附属第三医院手术及活检标本，液氮速冻后-20℃保存。经临床病理确定均为宫颈鳞癌。

　　1.2　质粒和菌种　克隆质粒为pCR2.1(Invirtogen US)；E.coli INV α F(Invitrogen US)；E.coli DH10B(GIBCO BRL)。

　　1.3　Caski细胞(含HPV16基因)为HPV16阳性对照，由日本大阪大学微生物病研究所提供。

　　1.4　引物的设计与合成　根据Seedorf等^［4］1985年发表的HPV16型DNA全序列，设计跨HPV16 L1整个阅读框的一对引物。引物1的序列为：5′-CTGACCAAGCTCCTTCATTA-3′；引物2的序列：5′-AACTATTGTGTCATGCAACA-3′。该引物扩增的靶序列均为1800 bp。由Cruachem Kyoto Research Centre合成。

　　1.5　试剂 TA Cloning Kit由Invitrogen US提供；PCR用Premix Taq Kit、DNA回收试剂盒及HindⅢ、EcoRⅠ、BamH Ⅰ等限制性内切酶由TAKARA提供；Sequencing Kit由日本Li-COR提供；DNA Marker由日本和光制药提供。

　　1.6　组织DNA的提取　采用酚氯仿萃提法^［5］。

　　1.7　PCR扩增　以宫颈癌组织DNA为模板，加HPV16 L1引物，按常规方法扩增HPV16 L1 DNA。扩增参数：94℃1min变性后进行35个循环，即94℃1min，55℃30 s，72℃2min。末次循环后再延伸7min。

　　1.8　HPV16 L1-pCR2.1重组质粒的构建　将PCR产物与克隆载体pCR2.1连接，并转化至E.coli INV α F中，经培养、蓝白斑筛选、增菌培养后提取质粒，并以EcoRⅠ和BamHⅠ酶切确定其正确性，再将其精制提纯后进行DNA序列测定。

　　1.9　亚克隆　HPV16 L1-pCR2.1重组质粒用限制性内切酶HindⅢ和BstEⅡ酶切后，回收4.9 kb DNA片段(切去L1 3'端0.8 kb)进行亚克隆，再提取亚克隆重组质粒精制后进行DNA序列测定。

　　1.10　DNA序列测定　用Sequencing Kit，采取PCR荧光素标记测序法对构建的3株重组质粒及亚克隆重组质粒中L1片段分别进行序列测定(日本Li-COR Model 4000)。微机处理将所得序列与HPV16 L1原始序列相比较。

　　2　结果

　　2.1　宫颈癌组织中HPV16 L1 DNA片段的扩增结果　以宫颈癌组织DNA为模板，用HPV16 L1引物进行PCR扩增，有3个标本为HPV16阳性，琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，可见一清晰扩增区带，其大小与预期值一致，为1.8 kb。

图1　宫颈癌组织DNA中HPV16 L1基因PCR扩增结果

A： 阳性对照；　B，C： 2号和5号标本的扩增结果；　M： 分子量标准

Fig.1　Result of HPV16 L1 gene amplification from cervical

　　carcinoma tissue DNA by PCR

　　A：Positive Control.　B：Sample 2.　C：Sample 5.　M：λDNA/HindⅢ+ψ174/HaeⅢ

　　2.2　HPV16 L1-pCR2.1重组质粒的克隆及亚克隆的构建　见图2。宫颈癌组织中扩增产物HPV16 L1 DNA与克隆载体pCR2.1连接，构建了重组质粒HPV16 L1-pCR2.1。将重组质粒HPV16 L1-pCR2.1用HindⅢ和BstEⅡ酶切，回收4.9 kb DNA片段进行亚克隆。酶切结果如图3。

图2　HPV16 L1-pCR2.1重组质粒克隆及亚克隆构建图

Fig.2　Clone and subclone strategy for HPV16 L1-pCR2.1

图3　HPV16 L1-pCR2.1/HindⅢ+BstEⅡ酶切凝胶电泳结果

　　M：分子量标准；　A：阳性对照；　B：标本1；　C：标本2；　D：标本5

Fig.3　HPV16 L1-pCR2.1 digestion by HindⅢand BstEⅡ

　　M：Marker.　A：Positive control.　B：Sample 1.　C：Sample 2.　D：Sample 5

　　2.3　HPV16 L1晚期基因序列测定及分析　对3个HPV16 L1-pCR2.1及亚克隆重组质粒，用PCR荧光素标记法测序，分别用T7 Promotor和M13 reverse primer对3株HPV16 L1 5'端和3'端进行序列测定。测定序列相当于HPV16原始序列的5 401-7 317。L1阅读框(ORF)从5 560(ATG)到7 278(TAA)为止。结果发现，3例中国妇女宫颈癌组织中HPV16 L1基因序列有4处均与Seedorf报道的HPV16 L1原型不同并影晌氨基酸变化，见表1。从表1看出，三个样品均与原始序列不同有4处，并由于核苷酸的改变，推测所编码氨基酸也发生变化。原始序列6241处的C变为G，核苷酸三联密码由TCA→TGA，其编码的氨基酸由甘氨酸(G)变为天门冬酸(D)；6433处核苷酸A变为G，核苷酸三联密码TAC变为TGC，其编码的氨基酸由苏氨酸(T)→丙氨酸(A)；6901与6902间，由于3个标本DNA中插入了3个核苷酸(CAT)，所以氨基酸序列中在此处多个丝氨酸(S)；原始序列6 949～6 951的3个核苷酸GAT，编码天门冬氨酸(D)，而3株标本DNA中均缺失该GAT，因此也缺少其编码的天门冬氨酸(D)。此外，还发现每个标本HPV16 L1 DNA序列还有1～2处点突变，但均没影响氨基酸变化。

　　－：表示不存在核苷酸或氨基酸－：Indicating no nucleotide or amino acid present3　讨论

　　为了对中国妇女感染的HPV16 L1基因序列进行分析，本研究从3例宫颈癌组织中扩增出HPV16 L1基因并对其进行克隆测序。结果3株中国妇女宫颈癌组织感染的HPV16 L1 DNA序列与1985年Seedorf报道的HPV16原始核苷酸序列有4处不同，这4处均由于三联核苷酸序列的变化而影响所编码氨基酸的改变，氨基酸发生变化，必定会影响到L1蛋白免疫原性的改变，为此我们认为对国人标本中扩增出的HPV16 L1晚期基因进行克隆和表达，进而制备基因工程疫苗时，就会更有效的预防中国区域流行株的感染。此外还发现每个标本病毒株核苷酸尚有1～2处与其他株不同，可能是病毒基因发生点突变所致，但均未影响氨基酸的变化。至于3个标本株有4处核苷酸发生相同变化的原因，尚须进一步深入研究和探讨。

　　(该课题得到日本大阪大学微生物病研究所羽仓明教授及汤通堂满寿男副教授的大力支持和帮助，在此一并表示感谢。)

　　本研究为黑龙江省科委重点攻关项目(编号：G98-C0803)

　　参考文献

　　1　Lowy D R, Kimbauer R, Schiller J T. Genital human papillomavirus infection. Proc Natl Acad Sci USA, 1994,91:2436-2440.

　　2　侯云德.分子病毒学.北京：学苑出版社，1990，181-185.

　　3　Jarrett W F H, Smith K T, O'Neil B W, et al. Studies on vaccination against papillomaviruses : prophylactic and therapeutic vaccination with recombinant structural proteins. Virology, 1991,184:33-42.

　　4　Seedorf K, Kraemmer G, Duerst M, et al. Human papillomavirus type 16 DNA sequence. J Virol, 1985,145:181-185.

　　5　Samrorook J, Fritsch E F, Maniatis T. Molecular Cloning : A laboratory manual, 2nd edition, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989.

(收稿：1998-03-06　　修回：1998-11-22)