内皮素对人肝癌细胞增殖作用的探讨
江苏医药 2000年第9期第26卷 论著
作者：林琳 杨树平 赵志泉 丁小健 汪承
单位：（210029 南京医科大学第一附属医院）
关键词：内皮素；细胞增殖；肝癌细胞
【摘要】 目的 探讨内皮素-2对人肝癌细胞增殖作用的影响。方法 该实验分为实验组及对照组，采用体外细胞培养法，以MTT法记录并反映人肝癌细胞的增殖效果。结果 实验组加入不同浓度的内皮素-2，培养24小时及48小时后，在浓度为10－9M时显示明显促进人肝癌细胞的增殖（P＜0.05，P＜0.01）。结论 内皮素是一种促肿瘤生长因子，与人肝癌的发生发展有一定关系。
Effect of endothelin on cultured human hepatoma cell line proliferation
LIN Lin，YANG Shuping，ZHAO Zhiquan，et al
（The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing，210029）
【Abstract】 Objective To study the effect of Endothelin-2 on cultured human hepatoma cell line-7721（HCC-7721）proliferation．Methods Human hepatoma cell line-7721 was used in this study with a control group．The promotion pattern of cell growth was observed with MTT assay．Results As compared with control group，ET-2（10－9M） markedly stimulated HCC-7721 proliferation，which had been cultured for 24 hours and 48 hours （P＜0.05，P＜0.01）．Conclusion These results suggest that ET may be a growth factor for human hepatoma cell lines，and related with development of human hepatoma．
【Key words】 Endothelin Cell proliferation Human hepatoma cell line-7721
内皮素（Endothelin，ET；ET-1、ET-2、ET-3等）是一组缩血管活性很强的多肽物质，随着临床研究的深入，发现其作用广泛且与恶性肿瘤生长有关。本文旨在用MTT法测定内皮素对体外培养的人肝癌细胞生长增殖的影响，从而阐明内皮素可作为一种生长因子，在肝癌发生、发展过程中的作用。
材料和方法
一、细胞培养
人肝癌细胞-7721（HCC-7721）由南京大学医药生物技术国家重点实验室提供。按常规法培养于含2.5％的小牛血清PRMI-1640全培养液中，置于37℃、5％CO2恒温孵育箱内，用接种传代第三天的细胞进行实验。
二、实验分组设计
设对照组与内皮素实验组，其中内皮素选择内皮素-2（ET-2，Sigma公司产品）并分别设终浓度为10－13M、10－11M、10－9M、10－7M。将上述培养的细胞消化后计数并稀释细胞悬液（3×105个细胞／ml），接种到96孔板上，贴壁后吸去培养液，取不同浓度的ET-2溶液（PRMI-1640为稀释液）加入96孔板内。对照组用PRMI-1640培养液。分别于24小时及48小时后加入MTT工作液50ml，4小时后吸去培养液，加入DMSO 0.2ml／孔，37℃，20分钟，570nm处测定吸光度［1］。各组实验均设复孔并重复3次。
三、数据处理
测得的吸光度OD值，统计学处理采用t检验（
±s）。
结果
结果见表1。从表中可以看出，在培养24及48小时后ET浓度为10－9M时，OD值明显高于同时间对照组的OD值（P＜0.05及P＜0.01），说明ET对体外培养的人肝癌细胞的增殖有明显的促进作用。
表1 不同培养时间、不同ET浓度对OD值的影响
| 培养时间 |
对照组 |
ET组（M） |
| 10－13 |
10－11 |
10－9 |
10－7 |
| 24小时 |
0.16±0.07 |
0.19±0.05 |
0.25±0.04 |
0.32±0.07 |
0.16±0.04 |
| 48小时 |
0.33±0.04 |
0.31±0.04 |
0.40±0.11 |
0.45±0.05 |
0.27±0.04 |
注：与同时间对照组相比，P＜0.05； P＜0.01
讨论
内皮素是新发现的血管活性物质，它与许多疾病如肝脏病密切相关，与恶性肿瘤的关系亦日益受到重视。临床研究发现肝癌患者血浆内皮素水平明显升高，并证明肝癌细胞可产生ET。Ishibashi等［2］报道30例原发性肝癌（HCC）患者血浆ET水平明显高于健康对照组，且与AFP有显著的相关性，对HCC患者进行肝动脉栓塞治疗后，肿块缩小，血浆ET水平亦下降，免疫组化分析发现肝癌细胞ET-1阳性，而毗邻的非肿瘤组织则阴性。还有人发现HCC患者的血浆ET-IR明显高于肝硬化患者［3］。然而ET升高的意义并不清楚。本文研究结果提示内皮素（ET-2，10－9M）明显促进体外培养的人肝癌细胞的增殖，说明内皮素是一种刺激肿瘤生长的因子，在恶性肿瘤的发生、发展过程中可能起重要作用。
本研究首次证实ET可促进人肝癌细胞的生长增殖。从结果中可看出在ET浓度为10－11M时即显示有增殖作用，10－9M时作用最明显，而10－7M时反而无增殖作用，可能由于浓度过高而不利于细胞的生长。内皮素的这种细胞增殖作用与其促进细胞外Ca2＋内流、肌浆网Ca2＋释放、以及促进与细胞增殖相关的基因表达有关。ET可使平滑肌细胞的DNA合成增加，增加细胞的有丝分裂和细胞的数目［4］。ET-1纯以剂量依赖的方式增加人的喉癌HEP-2细胞Ca2＋浓度，刺激静止期的癌细胞增殖和分裂，应用多克隆的ET-1抗体孵育HEP-2细胞，明显抑制这种增殖和分裂［5］。研究提示，拮抗内皮素这种作用必将对恶性肿瘤如肝癌的治疗等产生深远的影响。
肝癌细胞本身能够产生内皮素，本实验证实内皮素又能促进肝癌细胞的增殖。此外有人认为ET还能刺激肿瘤间质的增生，促进肿瘤血管的生长与构建过程，内皮素通过旁分泌或自分泌作用方式在肿瘤发生、发展甚至浸润转移过程中可能起重大作用，有关问题尚需进一步研究。
参考文献
1，郝新保，张利朝，殷缨，等．MTT比色法测定细胞生长曲线．第四军医大学学报，1997，18：390-391．
2，Ishibashi M，Fujita M，Nagai K，et al．Production and secretion of endothelin by hepatocellular carcinoma．J Clin Endocrinol Metab，1993，76：378-383．
3，Nakamuta M，Ohashi M，Tabata S，et al．High plasma concentrations of endothelin-like immunoreactivities in patients with hepatocellular．Am J Gastroenterol，1993，88：248-252．
4，吴建明，程彤，孙双丹，等．内皮素、血管紧张素和心钠素对血管平滑肌细胞和心肌细胞增殖的作用．中国科学（B），1992，5：509-513．
5，Schichiri M，Hirata Y，Nakajima，et al．Endothelin-1 is an autocrine／paracrine growht factor for human cancer cell lines．J Clin Invest，1991，87：1867-1871．
收稿：2000-01-06 修回：2000-04-12
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