吲哚美辛诱导慢性髓细胞白血病细胞凋亡的研究
中华血液学杂志 1999年第7期第20卷 论著
作者：涂传清 张广森 卢汉波
单位：410011长沙，湖南医科大学附属第二医院分子血液病研究室、血液科
关键词： 吲哚美辛；白血病，髓样，慢性；细胞凋亡；细胞增殖；基因，bcl-2
摘要 目的观察和确定吲哚美辛(IN)对慢性髓细胞白血病(CML)细胞凋亡的诱导作用，并部分揭示其分子机制，以期筛选一种新的抗白血病药物。方法以CML细胞株K562及来自6例初治Ph＋CML患者骨髓原代培养细胞为研究材料，在不同时间点，用不同浓度的IN进行干预，利用细胞形态学、流式细胞仪、DNA电泳、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)等技术，确定IN对CML细胞凋亡和增殖的影响。结果①IN能诱导K562细胞和原代培养的CML细胞凋亡，并有抑制白血病细胞增殖的作用；②IN对足叶乙甙诱导K562细胞凋亡具有协同作用；③IN能下调K562细胞中bcl-2mRNA水平表达，对baxmRNA水平无明显影响。结论IN能诱导CML细胞凋亡和抑制白血病细胞增殖，IN对足叶乙甙的抗白血病效应具有增敏作用。bcl-2基因表达下调可能为IN诱导CML细胞凋亡的重要机制之一。
Study of apoptosis induced by indomethacin in chronic myeloid leukemia
TU Chuanqing ZHANG Guangsen LU Hanbo
Laboratory of Molecular Hematology, Division of Hematology, The Second Affiliated Hospital, Hunan Medical University, Changsha 410011
Abstract Objective To explore the effect of indomethacin(IN) on the apoptosis of chronic myeloid leukemia(CML) cells, and its molecular mechanisms, for the purpose of screening a new antileukemic agent. Methods CML cell line K562 and fresh bone marrow cells from 6 untreated Ph＋ CML patients were used for in vitro culture study. The effects of IN on cells were determined by cell morphology, flow cytometry, DNA electrophoresis, and RT-PCR. Results ① IN induced apoptosis of K562 and fresh CML cells and inhibited the proliferation of K562 cells. ② A synergic effect of inducing K562 cell apoptosis was observed when IN combined with Vp16. ③ IN down-regulated the level of bcl-2 mRNA without changing the level of bax mRNA in K562 cells. Conclusion IN can induce apoptosis and inhibit proliferation in CML cells, and increase the sensitivity of CML cells to Vp16. Down-regulation of bcl-2 mRNA may be one of the mechanisms of CML cell apoptosis induced by IN.
Key words Indomethacin Leukemia,myeloid,chronic Apoptosis Cell proliferation Gene,bcl-2
吲哚美辛(indomethacin,IN)是临床上广泛使用的非甾体类抗炎药物之一，近来发现其有一定的抗白血病作用。1989年Brown等[1]的研究结果表明，IN在体外可抑制T淋巴细胞白血病细胞株的生长及活力。Dussault等[2]用IN和IL-2治疗红白血病小鼠，结果负瘤小鼠生存期明显延长。IN抗白血病的具体作用机制目前尚未完全明了，一些学者已发现IN可增强小剂量维甲酸或维生素D3对HL-60细胞诱导分化的效果，甚至较大剂量的IN(＞0.6mmol/L)单独亦可诱导HL-60细胞分化[3]；也有人证实IN可逆转多药耐药相关蛋白过度表达介导的白血病细胞多药耐药[4]。有关IN对白血病细胞凋亡有无影响，目前尚未见报道。我们将慢性髓细胞白血病（CML）细胞株K562和6例未经药物治疗的Ph＋CML患者的骨髓细胞作为研究对象，以确定IN是否具有诱导CML细胞凋亡的作用及其作用机制，并对IN在足叶乙甙（Vp16）诱导K562细胞凋亡中是否具有协同效应进行了观察，为筛选治疗CML的新药提供实验依据。
材料和方法
1 细胞培养 K562细胞引自本校分子生物学研究室。新鲜的CML细胞取自6例未经治疗的Ph＋CML患者骨髓(其中加速期1例，慢性期5例)，骨髓单个核细胞经FicollHypaque分离，无菌PBS洗2次，细胞培养于含体积分数为10％新生牛血清的RPMI1640培养基中，置37℃、体积分数为5％CO2孵箱中培养。
2 试剂 IN由湘雅医院张桂英教授惠赠(Sigma公司产品)，用二甲基亚砜（DMSO,Sigma公司产品)配成200mmol/L储液，置－20℃冰箱保存；Vp16注射液为北京制药工业研究所产品。
3 引物合成 β-actin和bcl-2引物参照文献[5]，β-actin正义链：5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3',反义链：5'-CTCCTTAATGTCACGCACGATTC-3',扩增产物长度为548bp;bcl-2正义链：5'-CGACGACTTCTCCCGCCGCTACCGC-3',反义链：5'-CCGCATGCTGGGGCCGTACAGTTCC-3'，扩增产物长度为318bp。根据bax基因cDNA序列[6]设计合成bax引物，正义链：5'-TCCACCAAGAAGCTGAGCGAG-3',反义链：5'-GTCCAGCCCATGATGGTTCT-3',扩增产物长度为257bp。上述引物由上海生工生物工程公司合成。
4 剂量反应曲线 收集对数生长期的K562细胞，配成浓度为2.0×105/ml的细胞悬液。实验组加入终浓度为100～800μmol/L的IN，对照组加入与最大药物浓度组等体积的DMSO，于给药后不同时相用台盼蓝拒染法计数活细胞，并依下式计算生长抑制率。
5 细胞形态学观察 细胞经离心涂片，Giemsa染色，光镜下观察细胞形态并进行凋亡细胞计数，每张玻片计数200个细胞。
6 流式细胞仪分析及DNA片段凝胶电泳 不同终浓度(0～800μmol/L)的IN与K562细胞共孵育72小时，按文献[7]的方法收集细胞，用FACSVantage流式细胞仪(美国BD公司)测定细胞周期分布及凋亡率。抽提DNA进行电泳[7]。
7 逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR） 按文献[5]的方法略加改进。1×106细胞经异硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法抽提总RNA，于37℃DNase(Promega公司)处理30分钟，苯酚、氯仿抽提，异丙醇沉淀，用体积分数为75％的乙醇洗1次，晾干后溶于20μl无RNase水中。cDNA合成：1.5μgRNA加入50pmol反义链引物本，70℃水浴10分钟，冰上骤冷后加入5×RT缓冲液4μl，10mmol/LdNTP2μl，RNasin40U,M-MLV逆转录酶200U，补无菌去离子水至20μl，42℃反应60分钟，95℃5分钟，4℃保存。PCR：50μl反应体系中含cDNA模板5μl，10×PCR缓冲液5μl，正义链和反义链引物各50pmol，10mmol/LdNTP2μl，Taq酶2U。bcl-2和β-actin的热循环条件：94℃预变性7分钟，然后94℃变性1分钟，72℃退火和延伸各30秒，30个循环后，72℃再延伸7分钟。bax循环条件改退火为60℃45秒，延伸72℃45秒，循环数为35个。取10μlPCR产物作20g/L琼脂糖凝胶电泳，用VDS凝胶自动成像，照片经薄层扫描求得每个待测产物与β-actin产物光密度之比，进行半定量分析。
8 统计学分析 记数资料采用χ2检验。
结果
1 IN对K562细胞的增殖抑制作用 图1显示IN明显抑制K562细胞增殖，200μmol/L作用48小时开始起效，72小时作用更明显，细胞增殖抑制率为44.3％,400μmol/LIN作用72小时细胞增殖抑制率为83％。
图1 IN对K562细胞的增殖抑制作用
2 IN诱导CML细胞凋亡分析
2.1 凋亡细胞的形态学观察：光镜下可见IN作用于K562细胞及6例Ph＋CML细胞引起典型的细胞凋亡特征，主要包括细胞核固缩、核裂解、核碎片弥散于细胞浆中、胞膜皱缩外突、凋亡小体形成。表1显示随着药物浓度的增加及作用时间的延长，凋亡细胞逐步增多。
2.2 流式细胞仪分析：200μmol/L、400μmol/LIN作用于K562细胞72小时，流式细胞仪测得典型的亚二倍体凋亡峰，凋亡细胞百分率分别为9.57％和46.65％，而对照组和100μmol/LIN组未出现明显的凋亡峰，凋亡细胞百分率分别为0.29％和0.44％。细胞周期分析发现400μmol/LIN作用72小时使S期细胞明显增加，由49.63％增至68.17％，大部分细胞阻滞于S期，G2/M期和G0/G1期细胞显著减少。
表1 IN作用于K562细胞不同时间凋亡细胞记数（％，
±s)
| 组别 |
IN浓度（μmol/L) |
不同作用时间凋亡细胞百分率（％） |
| 48h |
72h |
| 对照组 |
0 |
1.00±0.50 |
1.92±0.80 |
| 实验组 |
100 |
1.75±1.09 |
3.08±1.13 |
| |
200 |
5.83±2.08 |
12.67±4.01＊ |
| |
400 |
20.00±1.50＊ |
49.83±2.36＊ |
注：＊与同一时间对照组相比，P〈0.01
2.3 DNA裂解片段分析：图2显示400μmol/L及800μmol/LIN作用于K562细胞72小时，DNA凝胶电泳呈典型的梯状条带。当用20μg/mlVp16作用于K562细胞72小时，也出现DNA梯状条带。400μmol/LIN作用于6例Ph＋CML原代培养细胞72小时，DNA电泳亦出现明显梯状DNA条带。
1：分子量标准1；2：对照；3：IN100μmol/L; 4：IN200μmol/L; 5：IN400μmol/L; 6：IN800μmol/L; 7：Vp1620μmol/L; 8：分子量标准2
图2 IN诱导K562细胞的DNA电泳图
3 IN对Vp16诱导K562细胞凋亡的协同效应 单用100μmol/LIN或2.5μg/mlVp16作用于K562细胞72小时，凋亡细胞百分率分别为3.0％和5.0％，100μmol/LIN和2.5μg/mlVp16联合作用于K562细胞72小时，凋亡细胞百分率增至42.5％。DNA凝胶电泳分析显示100μmol/LIN和2.5μg/mlVp16单独作用于K562细胞未出现梯状DNA条带，两者联用则出现明显梯状DNA条带。
4 IN对K562细胞bcl-2和bax基因表达的影响 RT-PCR结果显示K562细胞bcl-2和bax基因表达阳性。200μmol/L和400μmol/LIN作用于K562细胞72小时可显著下调bcl-2mRNA水平,但对baxmRNA水平影响不明显(图3)。
1:分子量标准；2：K562；3：对照；4：IN200μmol/L;5:IN400μmol/L
图3 RT-PCR分析IN对K562细胞bcl-2和bax表达的影响
讨论
本研究结果表明，IN可显著抑制K562细胞增殖。IN的增殖抑制作用主要体现在阻滞细胞周期并诱导细胞凋亡。细胞周期时相分析显示：S期细胞百分比增加，G0/G1和G2/M期细胞明显减少,提示IN可抑制S期细胞向G2/M期的转换。此结果与Hanif等[8]对结肠癌细胞株的研究结果相似。
新近研究认为CML恶性克隆的持续扩增与细胞增殖及凋亡速率不平衡有关。K562细胞与其它白血病细胞株相比，对化疗药物诱导的细胞凋亡有更强的抵抗性，新鲜的CML细胞同样有很强的抗凋亡能力。因此，寻找新的凋亡诱导剂或增加白血病细胞对化疗药物的敏感性已成为一个迫切需要研究的问题。我们以K562细胞及新鲜的CML细胞作为IN作用的靶细胞，从白血病细胞凋亡通路入手，用不同浓度的IN作用于K562细胞及新鲜的CML细胞，结果从细胞形态学、DNA凝胶电泳、流式细胞仪分析多角度证实IN可诱导CML细胞凋亡，并呈浓度依赖性效应。我们的实验结果表明，IN主要通过影响细胞周期和细胞凋亡的速率产生抗白血病效应。因此，IN作为白血病细胞凋亡诱导剂，有着一定的临床应用前景。
我们还发现，IN显著增强化疗药物Vp16对K562细胞凋亡的诱导作用，其机制未明。有文献报道IN能逆转多药耐药相关蛋白介导的化疗耐药，增强多种化疗药物对多药耐药相关蛋白过表达白血病细胞株的敏感性[4]。IN对Vp16抗K562细胞表现的协同效应，是否涉及到多药耐药相关蛋白调节机制，有待进一步研究。
IN诱导细胞凋亡的机制目前尚未完全明了，我们利用半定量RT-PCR技术检测了IN对K562细胞bcl-2和bax基因的影响，对IN诱导细胞凋亡的调节机制进行了初步探讨。结果IN可显著下调bcl-2mRNA水平，但对baxmRNA水平无明显影响，使bcl-2/bax比值减少，这可能是IN诱导K562细胞凋亡的部分机制，即bcl-2表达下调部分介导了IN诱导的CML细胞凋亡。
综上所述，IN对慢性髓细胞白血病细胞株具有抗增殖和诱导凋亡作用；IN对Vp16的抗白血病作用具有协同作用。bcl-2基因表达的下调至少部分介导了IN诱导的K562细胞凋亡，这为临床上筛选新的抗白血病药物提供了初步的实验依据。有关IN抗白血病的合适药理剂量及确切机制，尚待进一步研究。
参考文献：
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6 Oltval ZN, Milliman CL, Korsmeyer SJ. bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog, Bax,that accelerates programed cell death. Cell, 1993,74:609-619.
7 张桂英,段朝军,施家琦，等.消炎痛抗肿瘤作用及体外增敏作用的研究.湖南医科大学学报，1997,22:478-482.
8 Hanif R, Pattas A, Feng Y, et al. Effects of nonsteroidal anti-inflammatory drugs on proliferation and on induction of apoptosis in colon cancer cells by a prostaglandin-independent pathway. Biochem Pharmacol, 1996, 52:237-245.
收稿：1998-08-10修回：1999-02-04
校对：徐丽娟
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