评分法研究复发急性白血病再生耐药现象

癌症 1999年第6期第19卷 临床研究

作者：陈燕，何明生，吴裕丹，李慧玉，喻东姣

单位：同济医科大学附属协和医院血液病研究所(武汉，430022)

关键词：再生耐药；急性白血病；细胞增殖；评分标准

　　【摘要】目的：建立评价急性髓性白血病(AML)再生耐药的方法。材料和方法：用白血病祖细胞培养(CFU-L)，MTT药物敏感试验，细胞周期中S期细胞百分比(S％)，细胞内柔红霉素(DNR)测定其荧光指数(FI)和耐药指数(DRI)，APAAP法测P-170糖蛋白表达以及半定量RT-PCR检测Bcl-XLmRNA表达丰度，评价AML细胞的药物敏感程度和增殖情况。首先选取初治AML病例研究评分指标与细胞耐药和细胞生长的相关性，其次对20例复发AML病例进行再生耐药评分。评分方法：①评分条件：患者有临床耐药表现，同时检测细胞药敏和细胞增殖情况；②评分标准：细胞药敏检测其结果为药敏评为2分，反之评为1分；细胞增殖检测细胞为细胞增殖过快评为2分，反之评为1分；凋亡抑制基因高表达评为2分，反之评为1分；③AML再生耐药评价：＜7分不属于再生耐药，≥7分可能存在再生耐药，≥9分为再生耐药。结果：20例复发AML中，9例评为再生耐药。结论：初步建立了再生耐药的评分方法；复发AML中存在再生耐药，克服再生耐药对确立新的治疗方案具有重要的临床意义。

　　中图分类号：R733.71文献标识码：A　　文章编号：1000－467X(1999)06－0720－04

Investigation of marking phenomenon of regrowth drug resistance in relapsed acute myelogenous leukemia

CHEN Yan,HE Ming-sheng,WU Yu-dan,et al.

　　Institute of Hematology,Xiehe Hospital,Tongji Medical University,

　　Wuhan 430022, P.R.China

　　【Abstract】Objective：To develop the method for evaluation of regrowth drug resistance in relapsed acute myelogenous leukemia (AML).Methods：Drug sensitivity and proliferation of leukemic cells in vitro were determined by leukemic cell colony forming unit (CUF-L)，MTT drug-sensitive test, percentage of S phase cells in cell cycle (S％),fluorescent index(FI) and drug resistant index (DRI) by detecting intracellular daunorubicin, expression of P-170 glycoprotein by APAAP assay,and abundance of bcl-XL mRNA by semiquantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR).Firstly, the correlation between scoring criteria and cell drug resistance and cell proliferation was investigated in newly untreated AML.Secondly, 20 patients with relapsed AML were marked.According to each tested result, its point(s) was scored, which the scoring methods were ①,eligibility：the subject's clinically drug-resistant manifestation;both drug sensitive and cell proliferative tests would at once be carried out;②,scoring criteria：drug-sensitive or cell proliferative result was scored 2 points,otherwise scored one point; overexperssion of antiapoptotic gene was scored 2 points,otherwise scored one point; ③,evaluation for regrowth drug resistance in AML：＜7 points for no regrowth drug resistance,≥7 points for the probability of regrowth drug resistance,and ≥9 points for regrowth drug resistance.Results：Scoring criteria studied were related to cell drug resistance or cell proliferation. Nine cases out of 20 relapsed AML were diagnosed as obviously regrowth drug resistance with this scoring method.Conclusions：The scoring method for regrowth drug resistance was first developed in AML.There was regrowth drug resistance in relapsed AML;clinically circumventing it would be of extreme signifiance for establishment of new approaches to the treatment in AML.　Key words：Regrowth drug resistance; acute myelogenous leukemia；Cell proliferation; Scoring criteria

　　1994年 Preisler和 Gropal^〔1〕提出再生耐药(regrowth drug resistance)的新概念：白血病化疗中细胞毒药物能大量杀灭白血病细胞，即白血病细胞对化疗药物敏感，但化疗结束后由于白血病细胞的快速再生或增殖，使化疗失败。再生耐药是白血病化疗失败的重要原因之一，也是常见但仍被忽视的重要临床现象^〔2〕。迄今，国外研究甚少，国内则完全没有开展系统的临床和生物学研究，缺少临床诊断和评价指标。由于再生耐药细胞具有对化疗药物敏感和快速生长(增殖)的两个特性，量化评价其特性并反映出再生耐药的程度对发现和研究临床常见的再生耐药现象具有重要意义。我们首先用初治急性非淋巴细胞白血病(AML)病例研究评分指标，初步建立了AML再生耐药评分方法，用该方法对20例复发AML进行再生耐药评分，现将研究结果报道如下。

　　1材料与方法

　　1.1量化评分指标与再生耐药的相关性

　　1.1.1白血病祖细胞集落形成单位(CFU-L)与细胞周期中S期细胞百分比和Bcl-XLmRNA表达丰度检测同时进行，方法参照文献〔3〕。CFU-L判断标准：≥40个细胞为集落生长，反之为不生长。

　　1.1.2MTT药敏实验：检测62例初治的成人AML患者，方法参照文献^〔3〕。MTT判断标准：按患者所用化疗方案中的药物，复发两种或两种以上药物细胞毒性指数(CI)＜30％为耐药，反之为敏感。

　　1.1.3P-170蛋白：检测38例初治的成人AML患者，方法参照文献^〔3〕。判断标准：油镜下计数200细胞，以细胞膜或胞浆红染为阳性，统计阳性细胞的百分率，阳性细胞≥20％为P-170蛋白表达阳性。

　　1.1.4细胞内柔红霉素(DNR)荧光指数(FI)和耐药指数(DRI)检测30例初治的成人AML患者，方法参照文献^〔4〕。判断标准：DRI=耐药细胞/药敏细胞，DRI≥2为耐药，DRI＜2为药敏；FI=平均荧光强度×DRI，FI≥200为耐药，FI＜200为药敏。

　　1.1.5白血病细胞周期中S期细胞百分比(S％)检测26例初治的成人AML患者，分离的白血病细胞用PBS(pH=7.2)洗两次，用4℃的70％乙醇固定30～60分钟后，用PBS洗去乙醇，将1×10⁶细胞加入1mlEB染液中(含EB10mg/L，RNA酶20mg/L)，4℃置30分钟后用流式细胞(FCM)检测，随机软件分析细胞周期并计算S％，每个样品检测10000个细胞。判断标准：≥4％为细胞增殖活性明显，反之为不明显^〔5〕。

　　1.1.6半定量RT-PCR检测Bcl-XLmRNA丰度：检测36例初治的成人AML患者。Trizol总RNA提取试剂盒和RT-PCR试剂盒均为GIBco-BRL公司产品，方法按厂方说明进行。用Trizol试剂盒提取总RNA。引物序列参照文献^〔6〕，由上海生物工程公司合成。Bcl-XL引物：TTGGACATTGGACTGGTTGA和GTAGAGTGGATGGTCAGTG。对照为β2微球蛋白(β2M)，其引物为：ACCCCCACTGAAAAAGATGA和ACTTTCAAACCTCCATGATG。反应总体积为50μl，模板为RNA1μg，引物各为20pmol，在试剂盒中另加入RNA酶抑制剂25u，用美国产PE-2400型PCR扩增仪扩增。取RT-PCR产物10μl，用1.5％琼酯糖凝胶(含EB0.5μg/ml)电泳结束后在紫外灯下观察结果并照相，产物Bcl-XL约800bp，β2M为114bp，用HPLAS-1000高清晰彩色病理分析系统扫描底片，用Bcl-XL积分光度/β2M积分光度之比值表示Bcl-XLmRNA的相对表达丰度。判断标准：≥1为高丰度表达，＜1为低丰度表达。

　　1.1.7疗效判断：临床化疗疗效标准按全国统一判断标准确定，治疗2个疗程以内评价，为完全缓解(CR)，或不缓解(NR)。初治的AML均采用HA(三尖杉酯碱＋阿糖胞苷)或DA(柔红霉素＋阿糖胞苷)3×7方案。

　　1.1.8统计方法：计算阳性符合率，进行卡方检验。

　　1.2复发AML再生耐药评分

　　病例参照国内白血病复发标准^〔7〕，选择20例复发AML患者，男13例，女7例，年龄20～72岁，均为我院经临床、细胞形态学、细胞化学和免疫分型初诊确诊，曾接受DA或HA方案诱导缓解，取得完全缓解(CR)，随后复发，复发后经原诱导方案化疗未取得第二次缓解(NR2)；复发时白细胞计数≥4×10⁹／L，均于再次化疗前取外周静脉血5ml，常规分离单个核细胞后，涂片检查白血病细胞≥90％。

　　1.3AML再生耐药评分方法

　　①评分条件：AML患者有临床耐药表现，同时检测细胞药敏和细胞增殖情况；②评分标准：细胞药敏检测结果为药敏评为2分，反之评为1分；细胞增殖检测结果为增殖过快评为2分，反之评为1分；细胞凋亡抑制基因高表达评为2分，反之评为1分；③AML再生耐药评价：＜7分不属于再生耐药，≥7分可能存在再生耐药，≥9分为再生耐药。

　　2结果

　　2.1评分指标与细胞药敏或耐药的相关性

　　见表1

表1　药敏或耐药评分指标比较

　　2.2评分指标与细胞生长(增殖)的相关性

　　见表2

表2　细胞生长(增殖)评分指标比较

　　2.320例复发AML再生耐药评分

　　2例评为7分，3例评为6分，6例评为8分，8例评为9分，1例评为10分，≥9分的AML患者可判断为再生耐药，可见复发AML患者，20例中有9例(占45％)存在明显的再生耐药现象，见表3。

表3　20例复发AML患者再生耐药评分

　　*注：DRI和FI合为一项评分

　　3讨论

　　理论和实验业已证明，白血病经过现代治疗按目前所确定的疗效标准取得CR后，体内仍残存微量的白血病细胞，这些残存细胞的生物学特征与后来白血病复发和预后的关系十分密切，因为它们再生或增殖的速率决定着白血病CR期的长短。再生耐药细胞是一类对细胞毒药物敏感，但增殖速率很快的细胞。由于人们长期习惯于将耐药与药物能否杀灭靶细胞联系起来，所以在临床上由再生耐药细胞所导致的再生耐药现象往往被忽视。事实上，临床上常见的再生耐药现象，一直存在于白血病和其它类型的肿瘤中，因其耐药程度不一，又由于它能与其它类型的耐药共存，故在临床上难于分辨某一耐药表型中是否存在再生耐药，要说明再生耐药的程度尤为困难^〔8〕。

　　所以，选用适当的量化指标来评价白血病再生耐药细胞的耐药程度就十分必要，唯此可以阐明其在构成耐药表型中所具有的重要意义，也才能为发现和克服再生耐药提供线索和指导。按照Preisler和Gropal^〔1〕两位学者提出的再生耐药概念，判断白血病再生耐药需要同时考虑白血病细胞对细胞毒药物的反应和它自身的增殖特性两个因素。为此，我们根据再生耐药的这一特点，尝试以量化评分的方法对AML再生耐药现象进行评分，以初步的量化方式评价该种耐药。

　　临床AML耐药的现象与实验室检测AML细胞耐药的结果有区别，也有联系；前者是一个临床概念，而后者仅为某项某次检测结果的判断而言。例如，对某AML患者进行MTT药物敏感性检测，其结果可为药敏而患者临床表现又可能是耐药，二者相左；但综合判断患者为AML再生耐药现象，二者结论并不相悖。所以在我们的评分条件中，首先要求AML患者有临床耐药的表现。其次，要求同步检测细胞药敏和增殖的情况，这是再生耐药细胞的两个基本特性的反映，既要检测药敏的参数，也要同时检测细胞增殖的参数以使评分合理，二者缺一不可。第三，关于评分方法，我们首先用初治AML病例研究了量化评分指标与细胞耐药和细胞生长(增殖)的相关性。这些指标中，MTT药敏实验、P-170糖蛋白与细胞DNR的FI、DRI与细胞耐药相关；细胞周期中S期细胞百分比和Bcl-XLmRNA与细胞生长相关。已有文献报道CFU-L提示与细胞生长的速度相关，而且提示与细胞自分泌生长相关。按照数量化理论的方法^〔9〕，同时考虑再生耐药细胞具有对化疗药物敏感和细胞增殖较快的特性，故将提示其特性的实验结果初步量化评分：提示耐药的评为1分，而提示细胞增长和药敏的评为2分。为什么耐药的结果在这里被评为1分?这说明它仍可能对再生耐药有一定的意义：①这一结果可能是相对的，如MTT法换用一些药物检测，其结果就可能为药敏而不是耐药；②P-170糖蛋白虽已知为经典耐药的因素，它一方面说明受检患者的耐药表型中或多或少存在经典耐药的因素，另一方面它的增加可能与某些凋亡抑制基因的功能有关，即间接地参与再生耐药细胞的存活或增殖，它所发挥的作用与其药物外排泵无关^〔10〕；③此外，耐药是多种机制共同作用的结果，因而再生耐药的判断并不排除经典耐药的存在，前者仅仅说明再生耐药在所形成的耐药表型中已具重要意义。

　　研究显示，Bcl-2基因家族通过对细胞凋亡(apoptosis)的调控在细胞耐药的形成和发展中发挥重要作用。Bcl-XL是Bcl-2基因家族成员之一，主要功能是抑制凋亡从而参与细胞耐药的机制。在本评分标准中，对Bcl-XLmRNA高表达评为2分，它肯定了这一基因在再生耐药中的重要意义，为基因治疗提供思路，也为克服再生耐药提供了一个重要的靶点。

　　复发AML属于耐药性AML中的一种。本实验中，对20例复发AML评分，其中9例评分≥9分，判断为再生耐药，这说明再生耐药现象在复发AML中较为常见。所以，克服再生耐药不仅仅是白血病治疗中的重要问题，而且对确定新的治疗方案亦具有重要的指导意义。本研究旨在建立初步的AML再生耐药现象的评分方法，但再生耐药的机制尚不十分清楚，评分系统有待进一步完善。

　　基金项目：本课题受卫生部科学研究基金资助(1996－2－108)

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收稿日期：1999－05－20；修回日期：1999－08－02