A/鹅/广东/2/96(H5N1)流感毒株7和8 RNA节段核苷酸序列测定

中华实验和临床病毒学杂志 1999年第4期第13卷 论著

作者：郭元吉　王敏　徐西雁　万秀峰　郭俊峰　董婕　张烨

单位：郭元吉、王敏、郭俊峰、董婕、张烨　100052　北京，中国预防医学科学院病毒学研究所；徐西雁　美国疾病控制中心；万秀峰　华南农业大学

　　关键词： 流感病毒；病毒，核糖核酸；碱基序列

　　【摘要】　目的　弄清A/鹅/广东/2/96(H5N1)毒株RNA 7和8核苷酸全序列及它们与A/HK/156/97(H5N1)毒株RNA 7和8之间的内在关系，并为今后流感病毒M和NS基因研究打下基础。方法　病毒粒RNA经逆转录合成cDNA,经聚合酶链反应(PCR)扩增，产物纯化，采用双脱氧链末端终止法进行核苷酸序列测定。结果　A/鹅/广东/2/96(H5N1)毒株RNA7长度为1 027个核苷酸，编码M1(含252个氨基酸)和M₂(含97个氨基酸)的蛋白。其RNA 8长度为890个核苷酸，编码NS₁(含230个氨基酸)和NS₂(含121个氨基酸)非结构蛋白。其M₁，M₂，NS₁和NS₂蛋白分子上氨基酸序列与A/HK/156/97(H5N1)毒株间同源性分别为97.6%，92.8%，65.7%和76.9%。结论　A/鹅/广东/2/96(H5N1)毒株RNA 7和8长度分别为1 027和890个核苷酸，此两节段RNA均属禽类毒株。A/HK/156/97(H5N1)毒株的RNA 7和8不是来自A/鹅/广东/2/96(H5N1)毒株。

Nucleotide sequence of A/Goose/Guangdong/2/96(H5N1) virus M and NS RNA

GUO Yuanji^*, WANG Min, XU Xiyan, et al. ^* Institute of Virology, Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing 100052

　　【Abstract】　Objective　To determine the nucleotide sequences of M and NS genes of A/Goose/Guangdong/2/96(H5N1) virus and also to compare them with the sequences of A/HK/156/97(H5N1) strain for revealing the relationship between the two viruses, as well as for setting up a solid base for studying M and NS genes of influenza A viruses in the future.Methods Virion RNA was transcribed into cDNA by reverse transcriptase, cDNA was amplified by PCR, the products of PCR were purified. Afterward, RNA sequence analysis was performed by the dideoxynucleotide chain termination method using synthetic oligodeoxynucleotide primers.Results The segment length of A/Goose/Guangdong/2/96(H5N1) virus RNA 7 is 1 027 nucleotides. It codes M₁(252 amino acids) and M₂(97 amino acids) proteins. However, the segment length of RNA 8 of A/Goose/Guangdong/2/96(H5N1) virus is 890 nucleotides coding NS₁(230 amino acids) and NS₂(121 amino acids) proteins. The amino acid sequence homologies of M₁,M₂,NS₁ and NS₂ protein molecules between A/Goose/Guangdong/2/9(H5N1) and A/HK/156/97(H5N1) viruses are 97.6%, 92.8%, 65.7% and 76.9%, respectively.Conclusion The lengths of A/Goose/Guangdong/2/96(H5N1) virus RNA 7 and RNA 8 and 1 027 are 890 nucleotides, respectively. These two RNA segments belong to those of avian influenza A virus. The A/HK/156/97(H5N1) virus RNA 7 and RNA 8 segments are not derived from those of A/Goose/Guangdong/2/96(H5N1) virus directly.

　　【Key words】　Influenza virus　　Virus, RNA　　Base sequence

　　1996夏，从广东病鹅中分离到两株H5N1亚型流感病毒，这是国际上首次发现H5N1亚型毒株能引起鹅发病和死亡。同时1977年5～12月我国特区发生了禽(H5N1)流感18例，其中死亡6例，引起世界普遍关注，并推测该病原来自我国内地的家禽。故有必要了解鹅H5N1毒株与香港禽H5N1毒株间到底有何内在的联系?本文报道鹅H5N1毒株RNA 7和8核苷酸全序测定及其与A/HK/156/97(H5N1)毒株分析比较的结果。

　　1　材料和方法

　　1.1　毒株　A/鹅/广东/2/96(H5N1)毒株来自华南农业大学，经9～10龄鸡胚传代增殖，含病毒粒新鲜的鸡胚尿囊液为使用病毒。A/HK/156/97(H5N1)毒株RNA 7和8的核苷酸序列及A/Turkey/England/91毒株RNA 8的核苷酸序列由美国疾病控制中心所提供。A/鹅/广东/2/96(H5N1)，A/HK/156/97(H5N1)和A/Turkey/England/91以下分别简称G96-2,HK97-156和Turkey91。

　　1.2　病毒粒RNA提取　见文献［1］。

　　1.3　引物、³⁵S-ATP、酶及试剂盒　引物、³⁵S-ATP，逆转录酶，PCR试剂盒，PCR产物纯化试剂盒以及Sequence system试剂盒均由美国CDC提供。

　　1.4　cDNA合成和聚合酶链反应　见文献［2］

　　1.5　核苷酸序列测定　采用双脱氧链终止法^［3］，基本步骤参考USB公司DNA sequence试剂盒^［1］。

　　2　结果

　　2.1　病毒粒RNA 7核苷酸全序测定和分析　G96-2毒株RNA 7长度为1 027个核苷酸。5′和3′末端分别有25和23个核苷酸长的非编码区，它最大的读码框架从26～28位核苷酸AUG起始编码子延伸到782～784位核苷酸编码子，编码一个含252个氨基酸长的膜蛋白(M₁)。RNA 7还编码一个含97个氨基酸长的M₂蛋白，它最初的9个氨基酸与M₁蛋白的最初9个是共同的，剩下的88个氨基酸由拼接的+1读码框架所编码，由741～1 004位核苷酸所编码。这与其它甲型流感病毒是相一致的^［4］。

　　根据所测出的M₁和M₂基因序列推导出M₁和M₂蛋白的氨基酸序列分别列于图1和2。

　　图1结果表明，G96-2与HK97-156毒株M₁蛋白分子间有6个氨基酸位点不同。它们分别位于15(V～I)，107(I～M)，144(F～L)，157(S～A)，231(N～D)和234(L～I)。两者同源性为97.6%。

　　图2结果指出，两者M₂蛋白分子上氨基酸序列有7个差异：10(L～P)，12(R～K)，14(G～E)，16(R～K)，55(F～L)和82(N～S)。它们同源性为92.8%。这些结果表明，M₂蛋白的同源性比M₁低，HK97-156的M基因不像来自G96-2毒株的M基因。

　　2.2　病毒粒RNA 8核苷酸全序测定和分析　G96-2毒株RNA 8节段的长度为890个核苷酸。它的5′和3′末端分别含26和29个核苷酸的非编码序列。从头一个起始密码子27～29开始至717～719所编码的为NS₁蛋白(含230个氨基酸)。RNA 8还编码一个NS₂蛋白(含121个氨基酸)，该蛋白头10个氨基酸与NS₁蛋白是共有的，剩下111个由+1的拼接读码框架所编码，即从529～531密码子至859～861密码子所编码。同样为使NS₁与NS₂蛋白分子上氨基酸序列不至于混淆，将NS₁和NS₂基因核苷酸序列推导出氨基酸序列分别列于图3和4。

　　图3结果指出，G96-2与HK97-156毒株NS₁蛋白分子上氨基酸序列相差81个位点，同源性仅为65.7%，而与Turkey 91相比较仅相差4个位点(166，170，182和224)，同源性高达98.3%。

　　图1　A/HK/156/97(H5N1)与A/鹅/广东/2/96(H5N1)毒株间M₁蛋白分子上氨基酸序列比较

　　Fig.1　Comparison of amino acid sequences on M₁ protein molecule between A/HK/156/97(H5N1) and A/Goose/Guangdong/2/96(H5N1) viruses

　　图2　A/鹅/广东/2/96(H5N1)和A/HK/156/97(H5N1)毒株间M₂蛋白分子上氨基酸序列比较

　　Fig.2　Comparison of amino acid sequences on M₂ protein molecule between A/Goose/Guangdong/2/96(H5N1) and A/HK/156/97(H5N1) viruses

图3　A/HK/156/97(H5N1)与A/鹅/广东/2/96(H5N1)毒株间NS₁蛋白分子上氨基酸序列比较

　　Fig.3　Comparison of amino acid sequences on NS₁ protein molecule among H5N1 viruses

　　图4结果显示，G96-2与HK97-156毒株NS₂蛋白分子上氨基酸序列相差28个位点，同源性仅为76.9%，而与Turkey 91的完全相同，同源性达100%。

图4　A/HK/156/97(H5N1)与A/鹅/广东/2/96(H5N1)

　　毒株间NS₂蛋白分子上氨基酸序列比较

　　Fig.4　Comparison of amino acid sequences on NS₂

　　这些结果清楚表明，G96-2的NS基因与HK97-156毒株的NS基因存在有明显的差异，而与Turkey 91的相似。根据美国CDC所提供的信息，按NS基因进化树分析，HK97-156病毒属A组，而Turkey 91毒株属B组。故可认为G96-2毒株NS基因属于禽和B组。HK97-156毒株的NS基因不是来自G96-2毒株。

　　3　讨论

　　H5N1亚型流感病毒对鸡和火鸡具有高致病性，近来发现它还能感染人并能造成死亡^［5］。然而一般认为对水禽均为不显性感染。故发现它对鹅具有致病性并造成死亡，这属首次发现。我国对流感病毒基因的研究多集中对编码HA和NA基因，对编码病毒粒内部蛋白基因，尤其非结构蛋白基因很少见。

　　甲型流感病毒RNA 7是否编码一个M₃小肽，至今尚未弄清^［6］。近来发现病毒粒M基因具有宿主的特异性，同宿主毒株间M₁基因比M₂保守得多^［4］，我们结果同样证实了这一点。

　　Ludwig等人^［7］报道了，甲型流感病毒NS基因可分为A和B两组基因系，而且两组间同源性很低。我们结果同样证实了这一点。NS₁蛋白分子长度波动很大，可从124～237个氨基酸^［6］，而G96-2毒株NS₁蛋白长度为230个氨基酸，即与绝大多数甲型流感病毒是相同的。

　　我们弄清了G96-2毒株RNA 7和8的核苷酸全序并推导出其所编码的蛋白氨基酸序列，为流感病毒基因库的建立打下了重要基础。弄清了此两节段RNA均属禽流感病毒，它们，尤其RNA 8不同于HK97-156毒株。

　　参考文献

　　1　郭元吉，董婕，王敏，等.甲3(H3N2)亚型流感病毒相变异分子生物学基础的研究.中华实验和临床病毒学杂志，1998，12：18-22.

　　2　Saiki RK, Gelfand DH, Stattels, et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science, 1988,239:487-492.

　　3　Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. Sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Nat Acad Sci U S A, 1977, 74:5463-5467.

　　4　Buokoer-white AJ, Naeve CW, Murphy BR. Characterization of a gene coding for M protein which is involved in host range restriction of an avian influenza A virus in monkeys. J Virol, 1986, 57:697-700.

　　5　Subbarao K, Klimov A, Katz J, et al. Characterization of an avian influenza A(H5N1) virus isolated from a child with a fatal respiratory illness. Science, 1998,279:393-396.

　　6　郭元吉，程小雯.流行性感冒病毒及其实验技术.中国三峡出版社，1997，16-33.

　　7　Lludwig S, Schultz U, Mandler J, et al. Phylogenetic relationship of the nonstructural(NS) genes of influenza A viruses. Virology, 1991, 183:566-577.

(收稿：1998-08-05　　修回：1999-01-27)