明胶-阿霉素抗癌缓释剂治疗膀胱肿瘤的体外研究

中华实验外科杂志 1999年第2期第16卷 论　著

作者：陈杰　叶章群

单位：430022　武汉，同济医科大学附属协和医院老年外科(陈杰)；同济医科大学附属同济医院泌尿外科(叶章群)

　　关键词： 膀胱肿瘤；阿霉素；明胶

　　【摘要】　目的　探讨明胶-阿霉素抗癌缓释剂治疗膀胱肿瘤的临床可行性。方法　应用含20%小牛血清的完全培养基浸泡明胶-阿霉素抗癌缓释剂，将不同时间所得的培养基分别行阿霉素药物浓度测定及与膀胱肿瘤细胞株BIU-87混合培养。结果　明胶-阿霉素抗癌缓释剂可于体外释放21天，第1至第19天释出药物对BIU-87细胞具有生长抑制作用，其释出药物浓度与BIU-87细胞生长率呈明显负相关(r=-0.6718,P＜0.01)。结论　明胶-阿霉素抗癌缓释剂应用于临床治疗膀胱肿瘤具有可行性。

　　 Experimental study in vitro on gelatia-adriamycin antineoplastic sustained release drug system in the treatment of bladder tumors 　CHEN Jie, YE Zhangqun. Department of Urology, Xiehe Hospital, Tongji Medical University,Wuhan 430022.

　　 　　【Abstract】　Objective　To investigate the possibility of the gelatia-adriamycin antineoplastic sustained release drug system (ASRDS) in the treatment of bladder tumors. Method　Gelatia-adriamycin ASRDS was impregnated into the culture-medium containing 20% bovine serum, and the medium was substituted every 24 h. Then the human bladder tumor cell line BIU-87 was incubated with the medium substituted every day. The level of adriamycin in medium was measured at the same time. Result　The ASRDS could release for 21 days in vitro, had growth suppression effects on the BIU-87 cell line from lst to 19th day. The growth rate of BIU-87 cells was negatively related to the level of adriamycin in the medium substituted every day (r=-0.6718,P＜0.01). Conclusion　Gelatia-adriamycin ASRDS could be used in the treatment of bladder tumors.

　　 　　【Key words】　Bladder tumors　　Adriamycin　　Gelatia

　　我们选用医用明胶作为药物载体，将抗癌药阿霉素掺入，经戊二醛分子交联后制成明胶-阿霉素抗癌缓释剂，通过测定这种缓释剂体外释放的时间和浓度，观察体外释放过程中对BIU-87细胞的生长抑制作用，以及释出阿霉素药物浓度与BIU-87细胞生长率之间的相关关系，从而初步判断明胶-阿霉素抗癌缓释剂治疗膀胱肿瘤的临床可行性。

　　 材料与方法

　　一、抗癌缓释剂的制备

　　称取10g医用明胶(分析纯，湖南常德明胶厂生产)， 置于烧杯备用， 以注射用水溶解 10mg 阿霉素(意大利爱宝大药厂生产)，抽出注入烧杯中，加注射用水至50ml处，充分搅拌，浸泡12小时，然后置60℃水浴箱内水浴15分钟，等明胶及阿霉素充分溶解后，以洁净之青霉素小瓶分装。每瓶5ml，数分钟后冷却成凝胶状，封瓶，钴60照射消毒，备用。将上述明胶-阿霉素混合剂置温水中浸泡5分钟，充分溶解呈液体状后，每5ml加25%戊二醛0.2ml混匀，保持流动性30～60分钟，即为明胶-阿霉素抗癌缓释剂。

　　二、明胶-阿霉素抗癌缓释剂的体外实验

　　1.抗癌缓释剂的体外释放方法　于超净工作台取明胶-阿霉素抗癌缓释剂0.5ml及20%明胶-25%戊二醛混合剂0.5ml(已消毒，明胶∶戊二醛=20∶1)，分别注入消毒培养瓶中，待其凝固后加入含20%小牛血清的完全培养基4ml(由本校细胞生物学教研室提供)，置入恒温培养箱内，于37℃下培养24小时后等量更换培养基，重复上述过程。将每天所得之明胶-阿霉素抗癌缓释剂及20%明胶-25%戊二醛混合剂浸泡过的培养基置于4℃冰箱待检。

　　2.抗癌缓释剂体外释药时间及浓度测定　取每天用体外释放法所得之明胶-阿霉素抗癌缓释剂浸泡过的培养基1ml，分别编号，用高压液相色谱法(HPLC)检测阿霉素的浓度。

　　3.明胶-阿霉素抗癌缓释剂对BIU-87细胞的生长抑制实验　取25ml无菌培养瓶若干个，每瓶接种BIU-87细胞2ml，浓度为4×10⁴/ml。分两组进行细胞培养，各组加样情况如下：①实验组：浸泡过明胶-阿霉素抗癌缓释剂的培养基1ml+完全培养基2ml。②对照组：浸泡过明胶-戊二醛混合剂的培养基1ml+完全培养基2ml。将每天浸泡所得3ml培养基分别与3瓶BIU-87细胞混合培养，37℃下培养3～4天后于倒置显微镜下观察BIU-87细胞的形态，而后以胰蛋白酶消化，收获细胞行胎盼蓝染色，计算活细胞数，然后按下式求出实验组BIU-87细胞的生长率：

　　生长率=×100%

　　把生长率小于80%视为释出药物对BIU-87细胞有生长抑制作用。

　　三、统计学处理

　　有关数据应用SAS软件系统行统计学处理。

　　结　果

　　1. 明胶-阿霉素抗癌缓释剂对BIU-87的生长抑制作用达19天，第20天释出药物与BIU-87细胞培养，其生长率为92.7%，超过80%，视为对BIU-87细胞无生长抑制作用(图1)。

图1　明胶-阿霉素抗癌缓释剂在不同时间对BIU-87细胞生长率的影响

　　2. 明胶-阿霉素抗癌缓释剂于体外释药时间达21天，最初2天释药浓度高，可达1000μg/L，而后稳定于200～600μg/L，释放17天，第20天药物浓度陡降，第22天即不能测知(图2)。将生长抑制实验中BIU-87细胞生长率与测得的阿霉素浓度行相关分析发现，两者呈明显负相关性(r=-0.67183,P＜0.01)。

图2　明胶-阿霉素抗癌缓释剂在体外不同时间的释药浓度

　　讨　论

　　我们应用含20%小牛血清的完全培养基浸泡明胶-阿霉素抗癌缓释剂，24小时后重复更换培养基，以模仿抗癌缓释剂体内释药情况，随后将每天浸泡所得的培养基与BIU-87细胞培养，发现直至第19天抗癌缓释剂浸泡过的培养基仍对BIU-87细胞具有生长抑制作用，这充分显示了明胶-阿霉素抗癌缓释剂的优势。因为肿瘤化疗的治疗效果等于有效药物浓度和释药时间之积，阿霉素缓慢释出，实为延长药物的半衰期，使得抗癌药物在肿瘤细胞增殖的多个周期中发挥作用，其抗癌效果肯定优于普通剂型的阿霉素^［1］，同时本研究还发现BIU-87细胞生长率与培养基中阿霉素浓度呈明显负相关，这充分说明对BIU-87细胞生长率的影响是来自于抗癌缓释剂所释放出的阿霉素。

　　因此，我们认为将抗癌药阿霉素渗入医用明胶与戊二醛形成的分子网络后，该药物能保持活性并缓慢释放，应用该方法制得的明胶-阿霉素抗癌缓释剂对人膀胱肿瘤细胞株BIU-87具有明显的杀伤作用，其长达19天的持续抗癌效应更是普通剂型化疗药物所不具备的。同时我们也有理由认为，该抗癌缓释剂应用于临床治疗膀胱肿瘤必将提高术后化疗的效果，降低肿瘤的复发率。

　　本课题为国家教委资助项目(教外国留［1995］806号)

　　 参考文献

　　1　吴开达，范健，高雪芝，等. 脂质体阿霉素治疗小鼠淋巴瘤的实验研究. 中国药理学通报，1993，9：268-271.

(收稿：1997-10-08　修回：1998-10-16)