HyTK基因用于膀胱癌基因-放射治疗的实验研究

中华放射医学与防护杂志 2000年第1期第20卷 基础研究

作者：叶传忠　裴雪涛　李梁　冯凯　杜楠　陈仕平

单位：叶传忠（福州，福建医科大学附属协和医院泌尿外科　350001）；陈仕平（福州，福建医科大学附属协和医院泌尿外科　350001）；裴雪涛（北京放射医学研究所）；李梁（北京放射医学研究所）；冯凯（北京放射医学研究所）；杜楠（第三军医大学）

关键词：潮霉素磷酸转移酶和HSV-TK的融合基因；膀胱肿瘤；基因-放射治疗；γ射线

　　【摘要】　目的　了解放射治疗协同单纯疱疹病毒-胸苷激酶(HSV-TK)/更昔洛韦(gancyclovir,GCV)对膀胱癌细胞的联合杀伤作用。方法　通过逆转录病毒介导，将潮霉素磷酸转移酶和HSV-TK的融合基因(HyTK)基因转入膀胱肿瘤细胞株EJ中并获得表达，联合应用放射治疗及低剂量GCV，了解基因-放射治疗对转基因细胞EJ/HyTK的杀伤作用。结果　Southern Blot、Dot Blot检测证实HyTK在转基因细胞的表达，联合应用低剂量GCV可使转入HyTK基因的膀胱癌细胞株对放疗的敏感性明显增高(SER=1.36)。结论　放疗协同HSV-TK/GCV 系统可作为膀胱癌基因治疗的一种有效方法。

Potential of HSV-TK gene in gene-radiotherapy

　　for human bladder carcinoma cells

YE Chuanzhong　PEI Xuetao　LI Liang, et al.

　　（Department of Urology,the Union Hospital,Fujian Medical University.Fuzhou 350001,China）

　　【Abstract】　Objective　To explore the killing effect of retrovirus-mediated HSV-TK/GCV system combined with radiotherapy on human bladder carcinoma cells. Methods By using retrovirus-mediated gene transfer technique,hygromycin phosphotransferase-thymidine kinase fusion gene (HyTK) was transferred into EJ bladder carcinoma cells. Antitumor effects were observed after irradiation with ⁶⁰Co γ-rays as well as gancyclovir treatment. Results EJ bladder carcinoma cells transduced with HyTK gene and treated with low concentrations of gancyclovir,which alone showed little cytotoxicity,were highly sensitive to radiation. The sensitizer enhancement ratio (SER) was 1.36. Conclusion The combination of retrovirus-mediated HyTK/GCV gene therapy with standard radiation therapy might improve the therapeutic effectiveness for bladder carcinoma in clinical practice.

　　【Key words】　Hygromycin phosphotransferase-thymidine kinase fusion gene;　Bladder carcinoma;　Gene-radiotherapy;　 γ-rays▲

　　肿瘤基因-放射治疗(gene-radiotherapy)是近年提出的肿瘤治疗新思路，主要研究方向之一是将同时具有肿瘤杀伤和辐射增敏作用(radiosensitization)的基因转入体内，在对肿瘤实施局部放疗时，造成辐射和基因对肿瘤的协同杀伤作用^［1］。新近的研究已表明单纯疱疹病毒-胸苷激酶(HSV-TK)基因具有辐射增敏作用^［2，3］。作者通过逆转录病毒介导，将潮霉素磷酸转移酶和HSV-TK的融合基因(HyTK)基因转入人膀胱癌细胞株EJ，联合应用放射治疗，探讨其协同作用，为其临床应用提供实验和理论基础。

　　材料和方法

　　1.细胞株：Ψ2细胞、PA317细胞由本室保存，人膀胱癌细胞株EJ由北京医科大学泌尿外科研究所提供，以上细胞均生长于DMEM培养基中，其中体积分数为0.1的胎牛血清和200 mmol/L的L-谷氨酰胺。培养于CO₂(体积分数为0.05)、37℃培养箱中。

　　2.γ射线照射源：北京放射医学研究所的⁶⁰Co γ射线源，吸收剂量率168.5 cGy/min。

　　3.主要试剂：DNA提取试剂盒DNAzol及RNA提取试剂盒Trizol为美国GIBCO公司产品；潮霉素、FuGENE^TM6转染试剂盒为德国BM公司产品；DNA回收试剂盒、小量质粒提取试剂盒、缺口平移系统、工具酶为美国Promega公司产品；鲑精DNA购自深圳晶美生物公司；〔α-³²P〕dATP购自福瑞公司；更昔洛韦(GCV)为美国Warner-Lambert公司产品；β-actin探针为本室保存。

　　4.逆转录病毒转染EJ细胞：质粒pL(HyTK)SN^［4］由本室构建。重组逆转录病毒pL(HyTK)SN和空质粒pLXSN经FuGENE^TM6及“乒乓效应”(ping-pong mechanism)依次转染Ψ2和PA317/pLXSN病毒包装细胞，经潮霉素筛选，获得产高滴度病毒的PA317/pL(HYTK)SN和PA317/pLXSN细胞株，分别制备病毒上清，转染EJ细胞，具体按文献^［4］方法进行。

　　5.转HyTK基因细胞系EJ/HyTK的鉴定：① Southern blot 分析HyTK基因的整合：HyTK基因cDNA探针用EcoRI、HindⅢ双酶切质粒tgCMV/HyTK获得，〔α-³²P〕dATP缺口平移法标记探计；参照DNAzol DNA提取说明书提取EJ/HyTK细胞基因组DNA，紫外吸收法分别定量12、8、6 μg DNA,XhoI、BamHI双酶切后电转印至尼龙膜上(Trans-Blot电转印室，Bio-Rad)，依次行预杂交、杂交、放射自显影，具体参照文献^［5］进行。② 外源基因在转染细胞的表达分析：〔α-³²P〕dATP标记β-actin探针作为内对照。按Trizol说明书提取细胞总RNA，甲醛变性电泳检测RNA的质量，紫外吸收法定量，按文献^［5］进行RNA Dot blot。

　　6.MTT法检测EJ/HyTK细胞对GCV的体外敏感性：参考文献^［6］，分别将EJ/HyTK及EJ细胞接种96孔板，每孔细胞数为3.6×10³，加入GCV使终浓度分别为100、10、1、0.1、0.01 mg/L，每一浓度作4个复孔，常规培养68 h后加入MTT20 μl (5 g/L)，4 h后酶联仪测定490 nm波长的A值，计算杀伤率及IC50值。同法分别接种EJ及EJ/HyTK细胞株，加入GCV (1、0.1 mg/L)，分别于24、48、72、96、120 h测定杀伤率。

　　7.⁶⁰Co 和GCV对转HyTK基因细胞的协同效应：将对数生长期的EJ细胞和EJ/HyTK细胞制备成单细胞悬液，分为EJ、EJ/HyTK、EJ/HyTK+GCV 3组，其中GCV用量为IC50的1%，根据MTT法检测出的GCV起效时间设定加药时间。分别照射吸收剂量为0、2、4、6、8、10 Gy后，不同浓度接种60 mm培养皿，两周后甲醛固定，Giemsa染色，光镜下计数大于50个细胞以上的克隆。参照文献^［7］，计算机分别按多靶单击模型(multi target single hit survival model)拟合数据，进行曲线拟合，绘出细胞存活曲线，所有结果均为3次平均值。

　　8.所有统计过程均在Slide、PMOS统计软件包中进行，以P＜0.05为显著性水平。

　　结　　果

　　1.HyTK基因的转染：用PA317/pL(HyTK) SN 病毒上清转染的EJ细胞经潮霉素(400 μg/ml)加压筛选3周，获得抗性克隆，命名为EJ/HyTK，培养传代。

　　2.Southern blot检测目的基因的整合：提取已导入目的基因的EJ细胞DNA，行Southern Blot，结果证实HyTK基因已整合进EJ细胞基因组DNA中。

　　3.Dot blot检测目的基因的表达：提取已转导HyTK基因的EJ细胞RNA，Dot blot结果证实EJ/HyTK细胞中已有HyTKmRNA表达。

　　4.GCV对EJ/HyTK细胞的体外杀伤作用：GCV对EJ/HyTK细胞有明显的杀伤作用。其IC50值为1.7 mg/L，而对其亲代EJ细胞无明显杀伤作用(P＜0.05)。其作用起效时间为48 h，96 h达到峰值，可杀伤绝大部分转基因细胞。

图1　按多靶单击模型拟合的受照射

　　EJ/HyTK细胞存活曲线

　　5.⁶⁰Co 和GCV对转HyTK基因细胞的协同效应：① 不同剂量照射后EJ/HyTK细胞与其亲代EJ细胞的存活曲线差异无显著性(P＞0.05)(EJ细胞组的数据未列出)。 ② EJ/HyTK组的D₀值为3.327 Gy，于照射前48 h加入GCV，用量为0.017 mg/L，转基因细胞经⁶⁰Co 和GCV协同效应后其SER(射线增敏率，sensitizer enhancement ratio)为1.36。两组细胞在不同剂量照射后的存活曲线见图1。

　　讨　　论

　　由缺陷型逆转录病毒介导的HSV-TK/GCV系统是目前众多肿瘤基因治疗方案中技术上较为成熟的一种，用它治疗恶性脑肿瘤及卵巢瘤的方案已在临床上获得批准；在泌尿系肿瘤方面，体内外实验均发现它能显著抑制人、鼠膀胱癌及前列腺癌细胞的生长。但其临床疗效并不十分理想，其主要原因之一是有效剂量的GCV (10 mg·kg^-1.d^-1)对机体可能产生严重的毒副效应，主要并发症有肾功能受损(40%～60%)、骨髓抑制(20%～41%)等^［8］，这大大的影响和限制了HSV-TK基因治疗的疗效和应用范围^［2］。而放疗是临床上应用最广泛和最重要的肿瘤治疗手段之一，在膀胱癌治疗中，配合根治性或部分膀胱切除术进行术前或术后放射治疗已取得肯定的疗效，但长期以来，肿瘤邻近部位正常组织的损伤，一直是困扰其疗效与应用的棘手问题。据统计，体外放疗在足量治疗后，一般膀胱并发症为8%～10%，重时出现的直肠损伤、挛缩性膀胱炎及膀胱纤维化有时需二次手术方可解决，个别患者甚至于出现膀胱直肠瘘或膀胱阴道瘘^［9］。可见，膀胱癌的放疗和基因治疗都是行之有效的治疗手段，但也都在各自的实践中存在不容忽视的问题。

　　肿瘤基因-放射治疗是近年提出的肿瘤治疗新思路，其主要研究方向之一是将同时具有肿瘤杀伤和辐射增敏作用的基因转入体内，在对肿瘤实施局部放疗时，造成辐射和基因对肿瘤的协同杀伤作用。新近的研究表明HSV-TK基因具有辐射增敏作用，其作用机理是基于当GCV进入HSV-TK基因转染的细胞内时，可三磷酸化成GCV-TP(三磷酸化GCV、GCV-triphosphate)，后者不仅能抑制癌细胞在辐射后PLD修复(潜在致死性修复，repair of potentially lethal damage)，还可作为三磷酸脱氧胸苷(dTTP)的竞争抑制物掺入DNA中以增加辐射的敏感性，从而可降低辐射剂量，减轻其毒副作用，增加疗效^{［2，3，10］}。我们利用逆转录病毒介导将HyTK基因导入EJ细胞，并在DNA、mRNA水平上均获得了表达。当联合应用⁶⁰Co 和远低于有效剂量的GCV时，转HyTK基因细胞对γ射线的敏感性有了较为明显的提高(SER为1.36)，这提示在将来的临床研究中有望利用放疗协同HSV-TK/GCV系统来达到治疗目的，从而降低单一治疗方法的毒副作用，提高疗效。

　　致谢：在进行本文实验过程中，北京放射医学研究所吕星博士、薛文成硕士、解放军兰州军区总医院赵红斌硕士、大连医科大学王晓博士曾给予多方帮助，在此表示感谢■

　　参考文献

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收稿日期:1999-02-22