¹³¹I-层粘连九肽的合成及在荷乳腺癌裸鼠中的显像和分布

中华核医学杂志 1998年第2期第0卷 论　　著

作者：王世真　周前　李世军　王德心

单位：100730中国医学科学院、中国协和医科大学北京协和医院核医学科（王世真、周前、李世军、），药物研究所（王德心）

　　关键词： 层粘连蛋白；肽类；化学；药物；乳腺肿瘤；放射性核素显像；小鼠；裸

　　【摘要】　目的　用¹³¹I-层粘连九肽进行荷乳腺癌裸鼠的肿瘤受体显像及其生物分布研究。方法　以固相法合成层粘连九肽,经HPLC纯化,用氯胺T法进行¹³¹I标记。标记物以Sephadex g-10纯化。尾静脉注入荷乳腺癌裸鼠体内,分别在1、2、3、4、5、6小时进行肿瘤显像,划出感兴趣区,测其T/B值。静脉给药后分别在3、6小时观察生物分布,计算其每克组织摄取注射剂量百分数(%ID/g)和肿瘤与非肿瘤的放射性比值(T/NT值)。结果　化学合成的层粘连九肽经HPLC、FAB-MS纯化鉴定,M+1=966.3。尾静脉注射后4～5小时肿瘤部位有明显浓聚,T/B值达4.62。肿瘤/肌肉的T/NT值在6小时为3.45。结论　¹³¹I-层粘连九肽有希望用于诊断人体乳腺癌。

　　¹³¹　I-LPA-Nonatide: synthesis, labeling and preliminary animal experiments　Wang Shizhen, Zhou Qian, Li Shijun, et al. PUMC Hospital, CAMS and PUMC, Beijing, 100730

　　【Abstract】　Purpose　Tumor-receptor imaging in nude mice bearing breast tumor was studied, using radiolabeled laminin peptide analog, ¹³¹I-LPA-Nonatide, synthesized in this laboratory.Methods LAP-Nonatide was synthesized by solid phase method. After purification with HPLC and identification, it was labeled with ¹³¹I by chloramine T method. The ¹³¹I-LPA-Nonatide, purified through Sephadex G-10, was injected through tail vein into tumor-bearing nude mice. Static images were acquired with gamma camera at 1, 2,3, 4, 5 and 6hr, respectively. Biodistribution was investigated at 3hr and 6hr after i.v. injection of ¹³¹I-LPA-Nonatide. %Injected dose/gram of tissue (%ID/g) and tumor/non-tumor (T/NT) values were calculated.Results LPA-Nonatide was identified by FAB-MS (M+1=996.3). The tumor was clearly visualized at 4～5hr after tail vein injection. T/B value at 5hr was 4.62. The T/NT for muscle at 6hr was 3.45.Conclusions ¹³¹I-LPA-Nonatide is a promising ligand to be used for receptor imaging of breast tumor.

　　【Key words】　Laminin　　Peptides　　Chemistry, pharmaceutical　　Breast neoplasm

　　radionuclide imaging　　Mice, nude

　　层粘连蛋白是基膜中一种主要的非胶原糖蛋白,具有多种生物活性。在乳腺癌和结肠癌中67000层粘连蛋白受体的表达明显增多。人乳腺癌比良性肿瘤或正常组织显示更高数量的细胞表面67000层粘连蛋白受体^〔1〕。雌激素和孕激素(已知能调节乳腺癌生长)大大增加了层粘连蛋白受体在乳腺癌细胞中的表达。层粘连蛋白被认为是肿瘤细胞在生长和转移过程中必须合成的基因产物^〔2〕,它对乳腺癌组织中67000层粘连蛋白受体的检测及肿瘤确诊有帮助。

　　层粘连蛋白(Mr=9×10⁵)有一个交联的结构,其活性区域是一个九肽CDPGYIGSR,在促进细胞粘附方面其活性比层粘连蛋白高10倍^〔3〕。将此九肽的C末端修饰为酰胺,可将其生物活性提高2倍^〔2〕。可能是C末端酰胺基团使肽失去原有的羧基上负电荷。此基团的氨基酸组成和序列是活性所必需的,序列的变化会使其活性降低或丧失。我们选择C末端的九肽CDPGYGISR-NH₂作为层粘连蛋白受体亲和剂,利用肽链中Tyr作为¹³¹I标记位点,以期找出一种乳腺癌的受体显像剂,用于乳腺癌的早期诊断。

材料和方法

　　1.层粘连九肽的化学合成。采用固相合成法。固相载体选用对甲基二苯甲氨基树脂(MBHA),容量1mmol/g(Applied biochem Co.出品)。选用BOC氨基酸保护系统,缩和方法为二环己基碳二亚胺(DCC)/羟基苯并三氮唑(HOBt)/二氯甲烷(DCM)或二甲基甲酰胺(DMF)或N-甲基吡咯酮(NMP)。

　　称取MBHA树脂0.5g(0.5mmol),装入固相反应管,用甲醇、DCM、DMF反复振荡洗涤,用精制干燥的DCM洗涤3次。取少量树脂用茚三酮试剂检测,呈黑蓝色。称取0.642g(1.5mmol)BOC-Arg(Tos)-OH,0.230g(1.5mmol)HOBt,用精制DCM/DMF溶解后,加入精制N-甲基吗啡啉0.165ml(1.5mmol)。密闭静置反应20分钟,大量二环己基脲析出,过滤,反应液加入固相反应管,振荡反应5小时。取少量树脂以茚三酮试剂检测,呈阴性。

　　将BOC-Arg(Tos)-MBHA树脂用2.3mol/L HCl/AcOH分别处理3、30分钟,DCM洗涤3次,DMF洗涤2次。6%三乙胺/DCM溶液中和2次,精制DCM洗涤4次,按照上述方法,依次接上BOC-Ser(Bzl)-OH、BOC-Gly-OH、BOC-Ile-OH、BOC-Tyr(BrZ)-OH、BOC-Gly-OH、BOC-Pro-OH、BOC-Asp(Chex)-OH和BOC-Cys(MeBzl)-OH。得到一个侧链保护的九肽树脂:BOC-Cys(MeBzl)-Asp(Chex)-Pro-Gly-Tyr(BrZ)-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Arg(Tos)-NH-MBHA。

　　采用氟化氢裂解肽树脂。裂解液中加入苯甲醚,HF浓度为90%,-5℃～0℃搅拌反应1.5小时。抽去HF,乙醚沉淀,冷冻干燥。HF裂解下来的粗肽比较复杂,用半制备HPLC分离纯化,收集第一肽峰。冷冻干燥,得白色絮状物60mg。快原子轰击质谱FAB-MS鉴定。

　　2. 层粘连九肽的标记。层粘连九肽用0.05mol/L乙酸水溶液配成0.3g/L溶液,氨胺T(CT)用0.05mol/L pH值7.4的PB配成0.3g/L溶液,Na₂S₂O₅用0.05mol/L pH值7.4的PB配制成3g/L溶液。均在标记之前新鲜配制。取Na¹³¹I溶液80μl(42.5MBq),依次加入PB溶液40μl,肽溶液40μl,CT溶液50μl,反应1分钟,Na₂S₂O₅溶液12μl终止反应。Sephadex g-10柱分离纯化,PB洗脱,选用新华1号纸,展开剂为甲醇∶水=1∶3。

　　3.乳腺癌细胞培养和荷瘤裸鼠模型。取液氮冻存乳腺癌细胞,解冻,常规方法培养细胞。培养液为RPMI-1640完全培养基。荷瘤裸鼠模型选用4周龄雌性裸鼠(购自中国医学科学院动物房)。所有用品、饲料均经高温高压消毒。于右下肢外侧皮下注射1ml乳腺癌细胞悬液(1×10⁷),共接种6只裸鼠。3天后再接种1次。约4周后,肿块长至0.5～1.0cm,于显像前3天饮用1%KI水溶液封闭甲状腺。

　　4. ¹³¹I-层粘连九肽荷乳腺癌裸鼠显像。¹³¹I-层粘连九肽由尾静脉注入裸鼠体内,注射剂量为12.2MBq,放射性浓度为17.4MBq/ml,分别在给药后1、2、3、4、5、6小时进行显像(Technicare sigma 420/550γ相机,针孔型高能准直器,距离动物5cm，¹³¹I能峰),每次显像条件保持一致。在显像图上划出裸鼠肿瘤部位感兴趣区，移到鼠体另一侧对应的非肿瘤区,计算不同时间点的T/B值。

　　5. ¹³¹I-层粘连九肽在荷乳腺癌裸鼠中的分布。取6只荷瘤裸鼠,每只裸鼠由尾静脉注射¹³¹I-层粘连九肽,剂量为2.59MBq,放射性浓度为3.7MBq/ml。分别在给药后3、6小时取3只裸鼠做生物分布研究,计算肿瘤与非肿瘤的放射性比值(T/NT)及每克组织摄取注射剂量百分数(%ID/g)。

结果与讨论

　　1. 层粘连九肽的化学合成和纯化鉴定。HPLC纯化后,冷冻干燥,得到的层粘连九肽纯品,外观为白色絮状物。快原子轰击质谱FAB-MS鉴定为目标产物,M+1=966.3,其分子式为:Cys-Asp-Pro-Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-NH₂。

　　2. 层粘连九肽的标记。用层粘连九肽上的Tyr标记¹³¹I,标记率为59.9%,纯化后放化纯度大于95%,得¹³¹I-层粘连九肽。CT用量比较关键,用量太少,会使¹³¹I离子的氧化不完全,标记率下降;用量太多会使蛋白质变性。为防止局部浓度过高而使蛋白质变性,配制的溶液浓度应较稀一些。反应投料配比一般为层粘连九肽∶CT∶Na₂S₂O₅=1∶1.5∶3。终止反应采用Na₂S₂O₅或牛血清白蛋白,效果无明显差别。

　　3. ¹³¹　I-层粘连九肽在荷乳腺癌裸鼠中的显像。荷瘤裸鼠显像图见图1。给药后4～5小时肿瘤显像清晰。4小时T/B值为4.62,5小时T/B值为4.16。所以,尾静脉注射后4～5小时肿瘤显像效果最好。

图1　¹³¹I-层粘连九肽在荷乳腺癌裸鼠中的显像

　　4. ¹³¹　I-层粘连九肽在荷乳腺癌裸鼠中的分布。3小时在心、肺、肝、脾、胃、肠、双肾、肌肉、肿瘤的%ID/g分别为0.67、0.71、0.50、0.50、3.56、0.55、1.11、0.47、0.69,6小时分别为0.86、0.93、0.67、3.17、7.22、0.80、0.51、0.40、0.93。可见胃的放射性明显高于其他组织。荷瘤裸鼠在3、6小时的T/NT值见图2。6小时组荷瘤裸鼠的各项T/NT值均高于3小时组。肿瘤/肌肉的摄取比值在6小时为3.45,在3小时为1.35。

　　¹³¹I-层粘连九肽尾静脉注入荷乳腺癌裸鼠,4～5小时肿瘤显影较清晰，表明¹³¹I-层粘连九肽能在乳腺癌中特异浓聚。¹³¹I-层粘连九肽在体内代谢快,显像时间短,体内代谢过程中存在脱碘现象,在6小时脾的%ID/g明显升高,¹³¹I-层粘连九肽逐渐在脾中浓聚。在6小时肾中的放射性大幅度下降,标记物主要经肾脏排泄。肿瘤的%ID/g在6小时为0.93,肿瘤与肌肉的T/NT比值在6小时为3.45。小肽的^99mTc标记尚有困难,所加螯合剂的体积相对过大,易破坏肽的构型,影响生物活性。¹¹¹In和¹²³I的性质比较合适,但目前在我国普及应用尚有困难。利用抗体进行肿瘤显像曾取得良好的结果,但有其难以克服的缺点。人们模拟抗体或天然物质的高可变区,设计合成高活性多肽已成为研究热点^〔5〕。多肽类受体显像剂是一个很有前景的发展方向,¹³¹I-层粘连九肽有希望用于人体乳腺癌的诊断。

图2　¹³¹I-层粘连九肽在荷乳腺癌裸鼠中的T/NT值

参　考　文　献

　　1　Rao CN, Barsky SH, Terranova VP, et al. Isolation of a tumor cell laminin receptor. Biochem Biophys Res Commun, 1983, 111:804-808.

　　2　Horan HP, Thor A, Schlom J, et al. Expression of laminin receptor in normal and carcinomatous tissues as defined by a monoclonal antibody. Cancer Res, 1985,45:2713-2718.

　　3　Humphries M, Akiyama SK, Komariya A. Identification of an alternatively spliced site in human plasma fibronectin that mediates cell type-specific adhesion. J Cell Biol, 1986, 103:2637-2647.

　　4　Graf J, Ogle RC, Robey FA, et al. A pentapeptide from the laminin B1 chain mediated cell adhesion and binding the 67　000 laminin receptor. Biochemistry,1987, 26:6896-6960.

　　5　Fischman AS, Babich JW, Strauss HW. Ticket to ride. J Nucl Med, 1993,34:2253-2263.

（收稿：1997-08-04　　修回：1998-03-09）