三苯氧胺逆转大肠癌多药耐药性的研究
中华实验外科杂志 2000年第1期第17卷 实验研究
作者：沈历宗 吴文溪
单位：（210029 南京医科大学第一附属医院普通外科）
关键词： 大肠癌；多药耐药性；三苯氧胺
【摘要】 目的 探讨体内应用三苯氧胺(tamoxifen,TAM)对大肠癌多药耐药性(multidrug resistance, MDR)的影响及其与雌激素受体(ER)表达的关系。方法 制成3组人大肠癌裸鼠移植瘤模型：mdr1(+)ER(+)组、mdr1(+)ER(-)组及mdr1(-)组。各组再分成4个亚组：对照组、阿霉素(DOX)治疗组、TAM治疗组及TAM+DOX联合治疗组。结果 mdr(-)组中DOX组及TAM+DOX组于第2疗程末瘤体积及瘤重均小于对照组(P＜0.05)，TAM组与对照组差异无显著性(P＞0.05)；mdr1(+)/ER(+)组中TAM+DOX组的瘤体积及瘤重均显著小于对照组(P＜0.05)，DOX组、TAM组与对照组均无明显差异；mdr1(+)/ER(-)组结果与mdr1(+)/ER(+)组相似。结论 三苯氧胺在荷瘤裸鼠体内应用能逆转植入大肠癌MDR，与是否表达ER无明显相关。
The effects of tamoxifen on multidrug
resistance of colon cancer in vivo
SHEN Lizong, WU Wen xi.
（Department of General Surgery, The First Affiliated Hospital,
Nanjing Medical University, Nanjing 210029,China）
【Abstract】 Objective To evaluate the effects of tamoxifen (TAM) on multidrug resistance (MDR) of colon cancer in nude mice and the depends on expression of estrogen receptor (ER).Methods The human colon carcinomas tissues with mdr1(+)/ER(+), mdr1(+)/ER(-) or mdr1(-) expression respectively were planted subcutaneously in nude mice. All animal models were divided into 4 subgroups: doxorubicin (DOX), TAM, DOX plus TAM treated group and control group. The xenografts were measured after each course of treatment and removed at the end of the experiments for measurements of weight and mdr1 mRNA level.Results In the animals with mdr1(-) tumor the weight of tumor in DOX and TAM+DOX group were less than that of the control (P＜0.05) significantly. In the models with mdr1(+)/ER(+) tumor the weight of the tumor was not affected by DOX or TAM treatment. However, the tumor weight in TAM+DOX group was less than that of control(P＜0.01) significantly, similar to the result of models with mdr1 (+)/ER(-) tumor.Conclusion The expression of mdr1 corresponds to the sensitivity of colon cancer to antitumor drugs in vivo. TAM can reverse the MDR of colon cancer in nude mice, which is independent of the expression of ER.
【Key words】 Colon cancer; Multidrug resistance; Tamoxifen
多药耐药性(multidrug resistance，MDR)是影响肿瘤化疗效果的重要因素。现已证明MDR主要是由mdr1基因编码的P-糖蛋白(p-glycoprotein,Pgp)介导的。我们通过建立mdr1/Pgp表达阳性的人大肠癌裸鼠移植模型，对动物模型使用三苯氧胺(tamoxifen,TAM)，研究体内应用能否获得增强化疗敏感性的作用，以及其作用与雌激素受体(ER)表达的关系。
材料与方法
1.MDR及ER的检测：MDR的检测采用RT-PCR，以β2-MG为内参照进行半定量分析。ER的检测采用免疫组织化学法。
2.裸鼠饲养及动物模型建立：BALB/C(nu/nu)裸小鼠购自中国科学院上海实验动物研究所，SPF级，鼠龄4～8周，体重15～25 g，雌雄兼用，饲养于超净生物层流架内，环境定期紫外线消毒，保持恒温恒湿。笼具、饮水、垫料、饲料均经高压蒸汽灭菌，实验操作均在无菌罩内进行。从我院大肠癌患者术前肠镜活检标本中检测ER及mdr1 mRNA表达，筛选3例大肠癌，其mdr1与ER表达情况分别为mdr1(+)/ER(+)、mdr1(+)/ER(-)、mdr1(-)。于手术时取得肿瘤组织，在肿瘤切断血供后30 min内接种于裸鼠颈部皮下，待各自成瘤后体积约达30 mm3时行鼠间传代， 以次代荷瘤鼠为实验用。
3.动物分组及用药：将mdr1(+)/ER(+)、mdr1(+)/ER(-)、mdr1(-)3组各自随机分成4个亚组：分别为对照组、单用DOX组、单用TAM组及DOX+TAM联用组，每小组为6只裸小鼠。TAM(每天15 mg/kg体重)用生理盐水制成混悬液后灌胃，DOX(3.6 mg/kg体重)行腹腔内注射，每一疗程中第1～7 d以TAM逐日灌胃，第7 d DOX腹腔内注射，第8～21 d不用药，第22 d开始第2个疗程。共计2个疗程。
4.观察指标及数据处理：实验开始及每个疗程结束测量肿瘤最大径(x)及最小径(y)，计算肿瘤体积(V=0.4xy2)，第2疗程末剥取肿瘤称重，并以RT-PCR检测mdr1 mRNA表达水平。不同瘤株及处理组间不同阶段瘤体积及瘤重进行比较，用q检验。mdr1(+)/ER(+)、mdr1(+)/ER(-)组实验前后mdr1 mRNA表达水平进行比较，用t检验。
结果
1.各组移植瘤的ER及mdr1表达情况与肠镜检测结果完全一致，并将治疗前测得的各组移植瘤mdr1 mRNA/β2-MG mRNA水平作为与治疗结束后比较的基值。
2.mdr1(+)/ER(+)组不同阶段瘤体积及瘤重见表1；mdr1(+)/ER(-)组不同阶段瘤体积及瘤重见表2；mdr1(-)组不同阶段瘤体积及瘤重见表3。
表1 mdr1(+)/ER(+)组鼠瘤体积与瘤重(
±s)
| 组别 |
瘤体积(mm3) |
瘤重(mg) |
| 实验前 |
第1疗程末 |
第2疗程末 |
| 对照组 |
7.52±1.39 |
62.63±10.16 |
507.45±93.34 |
634.23±119.41 |
| DOX组 |
7.84±1.61 |
57.58±8.36 |
465.92±72.94 |
581.05±89.77 |
| TAM组 |
8.00±1.47 |
59.22±8.53 |
483.68±81.96 |
603.05±103.39 |
| DOX+ |
8.64±1.38 |
44.37±4.02* |
340.35±22.28* |
425.50±28.58* |
| TAM组 |
|
|
|
|
注：与对照组比较，*P＜0.05
表2 mdrl(+)/ER(-)组鼠瘤体积与瘤重(±s)
| 组别 |
瘤体积(mm3) |
瘤重(mg) |
| 实验前 |
第1疗程末 |
第2疗程末 |
| 对照组 |
6.92±0.75 |
45.15±5.31 |
283.64±30.47 |
353.88±38.48 |
| DOX组 |
7.57±0.67 |
47.48±4.09 |
295.04±21.36 |
367.28±28.46 |
| TAM组 |
7.50±0.96 |
47.05±4.23 |
302.11±29.48 |
375.30±38.48 |
| DOX+ |
7.00±0.82 |
37.55±6.76* |
243.86±17.78** |
302.63±23.76** |
| TAM组 |
|
|
|
|
注：与对照组比较，*P＜0.05；**P＜0.01
表3 mdrl(-)组鼠瘤体积与瘤重(±s)
| 组别 |
瘤体积(mm3) |
瘤重(mg) |
| 实验前 |
第1疗程末 |
第2疗程末 |
| 对照组 |
3.37±0.29 |
14.53±2.30 |
36.42±2.77 |
45.48±3.92 |
| DOX组 |
3.23±0.28 |
13.32±1.90 |
31.44±1.61* |
39.10±2.29* |
| TAM组 |
3.45±0.43 |
13.39±1.18 |
35.47±3.50 |
44.57±3.74 |
| DOX+ |
3.30±0.31 |
13.40±1.16 |
31.31±1.74* |
38.72±2.56* |
| TAM组 |
|
|
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注：与对照组比较，*P＜0.05
3.mdr1(+)/ER(+)组实验前mdr1 mRNA/β2-MG mRNA为0.36；mdr(+)/ER(-)组实验前mdr1 mRNA/β2-MG mRNA为0.44。两组实验结束RT-PCR检测结果显示各组与对照组比较差异均无显著性(P＞0.05)。
讨论
本研究结果发现，不表达mdr1基因的大肠癌在应用DOX后约2个疗程瘤体积及瘤重明显小于对照组，而mdr1基因表达强阳性的大肠癌在单独应用DOX后肿瘤生长无明显影响，这从裸鼠体内试验证实了mdr1基因阳性表达与大肠癌对细胞毒抗肿瘤药物耐药性明显相关。
本研究结果发现，单独使用TAM对ER不同表达的大肠癌生长均无明显影响，而ER表达阳性的大肠癌使用TAM也未见肯定效果。体外实验发现，大剂量使用三苯氧胺可以获得足够浓度而能逆转Pgp/mdr1介导的MDR［1］。本研究旨在通过裸鼠实验研究体内使用TAM能否获得类似体外研究的结果，我们使用的TAM剂量显著高于目前用于治疗乳癌的常用剂量。本研究结果显示，对mdr1基因表达强阳性的大肠癌联合使用TAM后能增强DOX的抑制肿瘤生长作用，即可以逆转其MDR表型，增加化疗敏感性，且这种功效与肿瘤是否表达ER无明显相关。本研究还显示短期应用DOX、TAM等对肿瘤mdr1表达水平无太大影响。有研究认为MDR逆转剂本身一般不具备抗肿瘤作用，主要通过与抗肿瘤药物竞争Pgp上的结合位点，从而降低抗肿瘤药物的外流，增加细胞内药物蓄积，使肿瘤细胞恢复对抗肿瘤药物的敏感性［1］。
基金项目：江苏省教委自然科学基金资助项目(96039)
参考文献
［1］沈历宗，吴文溪，武正炎.大肠癌多药耐药性研究进展.国外医学外科学分册，1998，25：218-222.
收稿日期：1999-05-10
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