散发性大肠癌肿瘤相关基因位点杂合性丢失分析

中华实验外科杂志 1999年第6期第16卷 论　著

作者：孙孟红　Gebert J　Knebel Doeberitz Mv

单位：孙孟红　200032　上海医科大学肿瘤医院病理科分子病理研究室；Gebert J, Knebel Doeberitz Mv　Division of Molecular Diagnosis and Therapy, Dept. Surgery, University Heidelberg (INF 116, 69120 HD, Germany)

　　关键词： 肠肿瘤；肿瘤相关基因；杂合性丢失；肠，大

　　【摘要】　目的　分析大肠癌组织中抑癌基因及肿瘤相关基因位点的变化与预后的关系。方法　79例大肠癌组织经组织微解剖分离癌组织和正常组织，分别进行11个染色体上14个位点的杂合性丢失(loss of heterozygosity, LOH)分析。结果　肿瘤组织中LOH呈现一复杂的征象，5q12及RB基因位点的LOH与较好的预后有关。结论　不同的抑癌基因及肿瘤相关基因与大肠癌发生有关。5q12位点的LOH与较好预后相关的意义有待今后进一步研究。

LOH analysis of tumor associated gene loci in sporadic colorectal carcinoma

SUN Menghong^*, Johannes Gebert, Magnus von Knebel Doeberitz.

　　^*Institute of Molecular Pathology, Cancer Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai 200032

　　【Abstract】 Objective To analyze the changes in suppressor genes and tumor associated gene loci in sporadic colorectal carcinoma and their relation to the prognosis.Methods Matched tumor and normal DNA from colorectal cancer (CRC) of 79 patients obtained by microdissection and LOH analysis in the 14 loci in 11 chromosomes were performed.Results LOH was seen in 86% of the tumors. Analysis showed that the patients with LOH at 5q12 locus revealed a better prognosis.Conclusion Different tumor suppressor gene and tumor associated gene were related to the CRC development. The underlying molecular mechanism of a better prognosis in the patients with LOH at 5q12 locus has to be evaluated in further studies.

　　【Key words】 Lntestinal neoplasms Tumor associated genes LOH Interstine, large

　　我们选取14个多位于基因内的微卫星标志，分析大肠癌组织中这些抑癌基因及肿瘤相关基因位点的变化，现将结果报道如下。

　　对象和方法

　　1. 实验对象　大肠癌患者79例来自1986～1988年德国海德堡大学外科医院，其中男44例，女35例。平均年龄为66.6岁。24例肿瘤位于右半结肠，其余55例位于左半结肠。45例为结肠癌，34例为直肠癌。61例组织学分级Ⅰ～Ⅱ级，18例组织学分类Ⅲ～Ⅳ级。79例患者均未经任何术前抗肿瘤治疗。

　　2. 方法　经微解剖提得配对癌细胞(＞80%)和正常组织DNA模板。经PCR扩增的含微卫星序列的产物在ALF自动测序仪中行聚丙烯凝胶电泳。电泳结果用片段分析软件(Fragment Manager, Pharmacia)分析LOH结果。

　　3. 统计学分析　微卫星位点LOH与临床病理资料之间的相关性，着重分析与术后生存率的关系。Kaplan-Meier曲线与χ²分析用于随访资料的分析。

　　结果

　　LOH发生于83%(66/79)肿瘤中。每个病例LOH见于1～8个位点，13例肿瘤中可分析位点未见LOH。较高LOH见于18q12(69%)，DCC(72%)，p53(74%)。其他位点LOH介于20%～30%之间。D3S1611(hMLH1)显示29%的LOH。其中右半结肠5例、左半结肠5例、直肠4例。而D2S123(hMSH2相关)位点仅表现8.7%的缺失率。散发性大肠癌中LOH的分布及频度呈一非常复杂的征象，每一肿瘤显示在不同位点LOH变化，不同位点显示不同的LOH频率。

　　统计学分析发现，5q12及Rb基因位点LOH与预后相关。肿瘤显示5q12位点LOH的患者术后生存率明显高于无LOH的患者(P＜0.02)。同样的结果也在RB位点上见到(P＜0.015)。但将不同分期患者与LOH征象比较时，LOH与较好预后的相关性仅见于Ⅲ期5q12位点显示LOH的患者中。其它位点未见LOH与病后生存率的关系。LOH在左半结肠肿瘤中较多见，其中5q12、ACTC、DCC位点中LOH的频度在左侧大肠癌中显著高于右侧大肠癌(P=0.001，P=0.47，P=0.014，P=0.24)。

　　讨论

　　我们通过分析分布于11对染色体上的14个微卫星标志，结果发现，每一标志显示一个不同的LOH频度。在这一组病人中LOH的发生频度多为20%～30%，与新近报道的25%～30%相近^［1］。LOH在患病个体及总体中的复杂性反映肿瘤进展中的遗传不稳定性。Vogelstein组新近研究显示，大多数结肠癌在细胞分裂中表现出染色体分离异常，最终体现为染色体的倍体数异常及染色体物质的丢失或获得，并且在肿瘤细胞生存期中持续存在。他们的最新研究提示BUB1基 因与大肠癌中染色体不稳定性现象的发生有关^［2］。

　　5q在肿瘤中的高缺失率已经被学者们观察到。APC被认为是这一区域LOH的靶基因。以往的研究中未发现5q LOH与生存率相关性。在本课题中所用的微卫星标记位于5q12，尚未见报道此区域有抑癌基因位点。Tibodeau曾用同一微卫星标记在大肠癌中测得52%的LOH，也未发现其与预后的关系。我们对5q12位点的LOH分析可能提示：由于5q12位点特定的控制肿瘤生长的基因失活，足以使肿瘤形成、进展，而另一个或另一些重要的抑癌基因的失活不再是必须。这些保留的抑癌基因功能尚存而限制了肿瘤的复发和进展。最近报道一特异点突变型p53 minigene表现很强的体外抑瘤效应，而且较野生型p53基因的抑瘤效应更强^［3］。这提示并非所有LOH都具有促进肿瘤生长的作用。

　　我们在研究中选用了两个与抗原提呈有关的微卫星标志。TAP1和ACTC(在β 2-microglobulin基因附近)位点，它们的蛋白参与将内源性抗原性多肽运送到细胞表面，使免疫系统得以识别。这两个基因位点的LOH从另一角度证明免疫系统在肿瘤发生发展过程中也受到损伤。

　　DCC、p53和18q12位点显示很高的LOH频度，表明这些位点在大肠癌发生发展中的作用。DCC和18q12位点LOH多发生在左半结肠，说明这些基因更多影响左半结肠肿瘤的发生。但我们的研究未证实DCC与预后的关系。最近的两项研究得出与Jen相似的结果，即18q缺失和DCC基因的失活是影响大肠癌预后的不良因素^［4］。我们的实验结果与其他结果不同的原因可能是：(1)所用的微卫星标志不同，可能反映不同的基因位点变化和不同的分子生物学效应。(2)18q12区域的LOH不等同与DCC基因受损，这一区域的目标基因还有待于进一步研究。错配修复基因位点hMLH1显示29%的LOH，不表现部位特异性。hMSH2基因位点LOH只发生在8.7%(4/46)病例中，说明hMSH2在散发性大肠癌的发病中较少起作用。BRCA1基因是部分家族性乳腺癌的致病基因，在家族性乳腺癌中43%患者显示此基因失活。此基因的失活要求两个等位基因均受损。高达31%的BRCA1基因缺失说明这一基因位点在大肠癌的发病中起一定作用。

　　注：本课题为海德堡/曼海姆肿瘤中心(Tumorzentrum Heidelberg/Mannheim, IV-I-2)和德国癌症援助资助项目(Deutsche Krebshilfe 70-1940-Ge I)

　　 参考文献

　　1　Kinzler KW, Vogelstein B. Lessons from hereditary colorectal cancer. Cell, 1996,87:159-170.

　　2 Cahill DP, Lengauer Ch, Yu J, et al. Mutations of mitotic checkpoint genes in human cancers. Nature, 1998,392:300-303.

　　3 谢建武，吴秉铨，方伟岗，等.一种特异点突变型p53 minigene四环素负调控表达模式的抑瘤效应.中华病理学杂志，1998，27：328-332.

　　4　Ogunbiyi OA, Goodfellow PJ, Herfarth K, et al. Confirmation that chromosome 18q allelic loss in colon cancer is a prognostic indicator. J Clin Oncol, 1998,16:427-433.

(收稿：1998-12-28　修回：1999-04-10)