大肠癌CD44v6表达及其与肿瘤转移、细胞倍性的关系

中华实验外科杂志 1999年第6期第16卷 简　报

作者：欧启水　沈仲毅　陆佩华　周光炎

单位：200025　上海市免疫学研究所 上海第二医科大学［欧启水(现在福建医科大学附属第一医院检验科，邮政编码： 350005)、沈仲毅、陆佩华、周光炎］

　　为了了解CD44v6-细胞增殖/分化-细胞倍性三者之间的关系，探索CD44v6在肿瘤发生发展及肿瘤转移中的作用机理，我们进行了以下研究，现将结果报道如下。

　　一、材料与方法

　　1. 标本来源及处理　39例标本中女性23例，男性16例，年龄24～88岁，由瑞金医院外科提供。其中正常对照组9例(包括癌旁正常组织7例，正常人外周血淋巴细胞2例)；大肠腺瘤4例；大肠癌标本26例，其中未转移组(Duke′s A/B期)17例，转移组(Duke′s C/D期)9例。按肿瘤细胞分化程度分： Ⅰ级1例，Ⅱ级23例，Ⅲ级2例；按病理类型分类： 增生型10例，溃疡型12例，浸润型4例。取2 cm×2 cm大小的新鲜肿瘤块，参照文献［1］用胶原酶消化法收集肿瘤细胞。将细胞分成二部分，一部分抽提RNA，另一部分(约3×10⁵个细胞)按文献［2］处理。正常人外周血淋巴细胞用Ficoll分离得到。正常大肠粘膜对照取自远离癌组织的大肠。

　　2. 方法　应用流式细胞仪Facscan测定DNA含量及肿瘤细胞在细胞周期各相中的分布。具体方法参照文献^［2］进行。采用life technologies公司TRIzol Reagent抽提RNA；采用Super Script^TM试剂盒oligo(dT)_12-18引物合成第一链cDNA。具体步骤见试剂盒说明书。根据文献［3］设计CD44分子PCR扩增引物及扩增条件。根据文献［3］设计探针S1和D3，探针S1与标准型CD44分子结合，可确定细胞是否表达标准型CD44，探针D3(CD44v6)与CD44v6结合，可确定细胞是否表达CD44v6(或D3)。上述CD44扩增产物经电泳、转移、预杂交、杂交(同一张膜分别与D3、S1探针杂交)等过程，采用化学发光反应使X光片暴光，根据X光片上的条带有无，判断CD44s标准型及CD44v6的表达情况，此为定性结果。采用德国Kaiser公司的图像分析系统对X光片进行辉度扫描，包括图像输入、图像增强、图像分割、图像模式识别及数据分析等步骤，最后用数值表示X光片上条带的辉度值。

　　二、结果

　　正常对照组、腺瘤、未转移组及转移组CD44v6阳性率分别为0%(0/9)、25.0%(1/4)、64.7%(11/17)、88.9%(8/9)，呈逐渐升高之势。将正常对照组、腺瘤、未转移组及转移组4个实验组杂交条带进行辉度扫描定量分析，其辉度均值分别为： (175.87±43.16)、(2017.31±1429.9)、(2039.88±1568.78)、(10004.47±8013.36)，可见肿瘤转移组的CD44v6表达量比未转移组显著增加，二者差异有显著性(P＜0.05)。19例CD44v6阳性的标本中，其G₂M期的细胞占全部细胞百分率的均值为6.74%，7例CD44v6阴性的标本中，其G₂M期的细胞占全部细胞百分率的均值为5.57%。二者经统计学处理，差异无显著性(P＞0.05)。CD44v6阳性的19例标本中，细胞分化程度为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级的标本数分别为1、17、1例；CD44v6阴性的7例标本中，细胞分化程度为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级的标本数分别为0、6、1例。二者经统计学处理，，差异无显著性(P＞0.05)，说明CD44v6表达与肿瘤细胞分化程度无关。26例肿瘤标本中，二倍体10例，其中1例发生转移，占10.0%；异倍体细胞16例，其中8例发生转移，占50.0%，二者经统计学处理，差异有显著性(P＜0.05；χ²=4.35)。CD44v6阳性的19例标本中，二倍体6例，异倍体13例，异倍体细胞占68.42%；CD44v6阴性的7例标本中，二倍体4例，异倍体3例，异倍体细胞占42.86%。二者经统计学处理，差异无显著性(P＞0.10；χ²=1.42)。

　　三、讨论

　　本实验结果显示CD44v6的阳性表达与肿瘤的发生、发展密切相关。辉度扫描结果显示，转移组CD44v6的表达量明显高于其余3个组，从而在分子水平上证实CD44v6与转移是高度相关的。个别腺瘤标本表达CD44v6，提示我们CD44的交替拼接可发生在肿瘤发生、发展的早期阶段。结果中可见未转移组中CD44v6阳性的病人数高达64.7%，这是由于我们判定肿瘤是否发生转移主要依靠病理学分析，无法排除已发生的极微量的转移或具有转移潜能的肿瘤细胞，因此，这些临床上判断为未转移的肿瘤，也许已经具备了转移的潜能和能力或者已有微小转移灶，只不过传统经典的病理分析还不能检测出而已。我们的研究提示CD44v6表达与细胞的分化和增殖可能是无关的，因此，CD44v6通过增加细胞的增殖、分化而引起肿瘤发生、发展的可能性不大。本实验还提示异倍体细胞的转移发生率明显高于二倍体细胞，且与转移有关的CD44v6的表达与肿瘤细胞的倍性无关。

　　注：本课题为国家自然科学基金资助项目(No.39570783)

　　参考文献

　　1　鄂征主编. 组织培养和分子细胞学技术. 北京出版社，1995. 82-88.

　　2　王玲，藏人杰，周光炎. 人类大肠癌不同倍性细胞HLA抗原表达格局的差异及其与转移的关系. 中华肿瘤杂志，1992，14：175-177.

　　3　Matsumura Y, Tarin D. Significance of CD44 gene products for cancer diagnosis and disease evaluation. The Lancet, 1992,340:1053-1058.

(收稿： 1999-02-15)