大肠癌细胞p53基因突变与细胞凋亡及细胞倍性的关系

中华实验外科杂志 1999年第5期第16卷 论著

作者：欧启水　沈仲毅　陆配华　周光炎

单位：沈仲毅　陆佩华　周光炎　(200025　上海第二医科大学上海市免疫学研究所)；欧启水　(福建医科大学附属第一医院检验科　邮政编码：350005)

　　关键词： p53；细胞凋亡；细胞倍性；基因突变

　　【摘要】　目的　了解p53基因突变、细胞倍性、细胞凋亡三者的关系，探讨突变型p53基因在肿瘤发生中的作用机制。方法　采用PCR-SSCP(单链构象多态性)检测p53基因突变，用流式细胞仪Facscan检测大肠癌细胞染色体倍性、凋亡率及其在细胞周期各相中的分布情况。结果　大肠癌标本p53基因突变率为50%；其中突变组肿瘤细胞凋亡率(22.11%)明显低于未突变组细胞凋亡率(40.57%)，(P＜0.05)；突变组异倍体细胞百分率(占76.9%)明显高于未突变组(占46.2%)，(P＜0.05)；异倍体肿瘤细胞凋亡率为34.0%，二倍体肿瘤细胞凋亡率为40.7%，二者差异无显著性(P＞0.05)。结论　p53基因突变使肿瘤细胞凋亡率下降，进而促进肿瘤发生、发展。p53基因突变多见于异倍体细胞，细胞凋亡率与细胞倍性无关。

Relationship between p53 gene mutation of colorectal cancer cell, apoptosis and cell ploidy

OU Qishui,SHEN Zhongyi,LU Peihua,et al.

　　(Shanghai Institute of Immunology,Shanghai Second Medical University,Shanghai 200025)

　　【Abstract】Objective To study the relationship among p53 gene mutation, apoptosis and cell ploidy and explore the role that mutated p53 gene plays in the tumorigenesis.Methods p53 gene mutations were detected by PCR-SSCP (single strand conformation polymorphism). Cell ploidy, the rate of apoptosis of tumor cells and cell distribution in each cell phase were detected by flow cytometry.Results The p53 gene mutation rate of colorectal cancer was 50%. The rate of apoptosis of tumor cells having mutation of p53 gene (22.11%) was much lower than that having no p53 mutation (40.57%, P＜0.05). Heteroploid cells had been found in 10/13 tumor samples with p53 gene mutation and 6/13 samples without p53 mutation (P＜0.05). The rate of apoptosis had no difference between the heteroploid cases and diploid cases.Conclusion Mutation of p53 gene decreases the apoptosis rate of colorectal cancer cells and promote tumorigenesis. Cell ploidy had a link with p53 gene mutation, but no link with cell apoptosis.

　　【Key words】 p53 Apoptosis Cell ploidy Gene mutation

　　我们对p53基因突变与大肠癌发生发展的关系，尤其是p53基因与新鲜大肠癌细胞凋亡的关系进行研究，现将结果报道如下。

　　材料与方法

　　1. 标本来源　39例标本均由上海瑞金医院外科提供，其中正常对照组9例(包括癌旁正常组织7例，正常人外周血淋巴细胞2例)；大肠腺瘤4例；大肠癌标本26例，其中未转移组(Duke's A/B期)17例，转移组(Duke's C/D期)9例。其中女性23例，男性16例，年龄24～88岁。

　　2. 标本处理　取2cm×2cm大小的新鲜肿瘤块，用胶原酶消化法收集肿瘤细胞^［1］。将细胞分成二部分，一部分细胞按常规方法抽提DNA并配制终浓度为0.1μg/L的应用液于-20℃保存，另取至少3×10⁵个细胞留作下述处理。正常人外周血淋巴细胞用Ficoll分离得到。正常大肠粘膜对照取自远离癌组织的大肠。

　　3. 肿瘤细胞DNA含量测定　用流式细胞仪Facscan测细胞DNA含量及肿瘤细胞在细胞周期中各相中的分布^［2］。将细胞分为二倍体、三倍体、四倍体、非整倍体和多异倍体。同时根据肿瘤细胞DNA片段化情况，检测每份标本中发生凋亡的肿瘤细胞的百分率。

　　4. p53基因突变的检测　采用PCR-SSCP(单链构象多态性)检测p53基因第5、6、7、8共4个外显子的突变情况^［3］。

　　结　　果

　　1. p53基因突变情况见表1。

表1　各实验组p53基因突变情况

注：^*“突变数”与第5、6、7、8各个外显子突变数之和不同，是由于部分标本同时在二个外显子发生突变

　　2. p53基因突变与G₂M期细胞百分率　13例p53基因突变的大肠癌细胞经流式细胞仪检测，其G₂M期细胞占全部细胞百分率的均值为9.42%，而13例p53基因未发生突变的大肠癌细胞中，G₂M期细胞占全部细胞总数百分率的均值为3.43%。二者差异有显著性(P＜0.05)。相反，二组位于G₁的细胞数均值分别为74.62%和80.65%，位于S期的细胞数均值分别为15.96%和15.92%，二者差异无显著性(P＞0.05)。

　　3. p53基因突变与癌细胞凋亡率　经流式细胞仪检测癌细胞染色体DNA片段化，可知突变组细胞凋亡率均值为22.11%，而未突变组细胞凋亡率均值为40.57%，二者差异有显著性(P＜0.05)。

　　4. p53基因突变与细胞倍性　p53基因突变的13例肿瘤标本中，异倍体10例，占76.9%；p53基因未突变的肿瘤标本中，异倍体6例，占46.2%，二者差异有显著性(P＜0.05)。

　　5. 肿瘤细胞凋亡率与细胞倍性　异倍体16例细胞中，细胞凋亡率平均为34.0%；二倍体10例细胞中，细胞凋亡率平均为40.7%，二者差异无显著性(P＞0.05)。

　　讨　　论

　　本实验结果显示，p53基因突变引起细胞增殖旺盛，进入G₂M期的细胞增加，同时可以看到p53基因突变组的细胞凋亡率下降。这些结果证实了Lane提出的p53基因充当“分子警察”的假说^［4］。说明在大肠癌的发生、发展过程中，p53通过引起细胞的恶性增殖，降低肿瘤细胞的凋亡率而导致肿瘤的发生。另一方面，我们可以看到p53突变的细胞凋亡率为22.1%，而p53未突变的细胞凋亡率也只有40.6%。因此，尽管p53突变引起细胞的凋亡率下降，但野生型p53基因不是启动细胞凋亡的唯一因素。

　　我们通过本实验利用新鲜的大肠癌标本证实了p53基因突变使肿瘤细胞不能凋亡进而导致肿瘤发生的事实，为阐明肿瘤发生、发展机理提供了有益的实验数据。Tomisaki^［5］及Katharina^［6］等人以胃癌为研究对象，发现DNA为异倍体的肿瘤细胞具有高p53基因突变。本研究结果显示16例异倍体细胞中有13例p53基因发生突变，突变率高达81.3%，与国外文献报道相符。

　　本课题为国家自然科学基金资助项目(No.39570783)

　　参考文献

　　1　鄂征主编.组织培养与分子细胞学技术.北京：北京出版社.1995，82-88.

　　2 王玲，藏人杰，周光炎.人类大肠癌不同倍性细胞HLA抗原表达格局的差异及其与转移的关系.中华肿瘤杂志，1992，14：175-177.

　　3 欧启水，王灏，沈仲毅，等.银染PCR-SSCP检测大肠癌p53基因突变.中国实验诊断学，1997， 1：35-37.

　　4 Lane DP. p53, guardian of genome. Nature, 1992, 358:15-18.

　　5 Tomisiki S, Tatsuo O, Hisao O, et al. DNA ploidy pattern and p53 overexpression In gastric cancer. Gan To kagaka Ryoho, 1995,22(supp12):115-118.

　　6 Katharina W, Hans F, Margot H, et al. p53, Ki-ras adn DNA ploidy in human pancreatic ductal adenocatcinomas. Lab Invest, 1996, 74:279-281.

(收稿：1998-12-01　修回：1999-02-15)