白头翁对二甲基肼诱发小鼠大肠癌的防治作用和机理研究
中药药理与临床 1999年第5期第15卷 实验研究
作者：章荣华 张仲苗 耿宝琴 雍定国
单位：章荣华 浙江省卫生防疫站毒理科 杭州 310009；张仲苗 浙江医科大学附属第二医院药剂科 杭州 310009；耿宝琴 雍定国 浙江大学药理学教研室 杭州 310031
关键词： 白头翁；二甲肼；大肠癌；超氧化物歧化酶；谷胱甘肽过氧化物酶；增殖细胞核抗原
提 要 本文研究了白头翁对二甲肼(DMH)诱发小鼠大肠癌的防治作用及其可能机理。结果发现白头翁醇提物组小鼠大肠癌发生率(63.6%)较模型组(100%)明显降低(P＜0.05)；白头翁各用药组大肠癌发生数目亦显著低于模型组(P＜0.01)，且大肠癌的病理进展较慢。各用药组小鼠红细胞SOD活性和全血GSH-Px活性较模型组均有显著升高(P＜0.05)，各预防用药组PCNA-LI值亦低于模型组(P＜0.05)。提示白头翁不同提取物对DMH诱发小鼠大肠癌均具有一定的防治作用，预防作用优于治疗作用，醇提物的作用较强。其机制与保护SOD、GSH-Px的活性以清除DMH引发形成的自由基及抑制肠粘膜细胞的增殖活性有关。
The Preventive and Therapeutic Effect of Radix Pulsatillae on Mice Colorectal Cancer Induced by Dimethylhydrazine
Zhang Ronghua(The Health and Epidemic Prevention Station of Zhejiang Province Hangzhou 310009)
Geng Baoqin, Yong Dingguo(Department of Pharmacology, Zhejiang University Hangzhou 310031)
After discovering the antitumor effect on mice transplanted tumor of different extracts of Radix Pulsatillae (Baitouweng, BTW), this study was done further to observe their preventive and therapeutic effect of BTW on mice colorectal cancer model induced by dimethylhydrazine (DMH) and the mechanism was also explored preliminarily. Compared the DMH model group, the mice colorectal cancer incidence of BTW alcohol extract group and the number of tumors of all BTW-treaded groups were decreased significantly. Furthermore, the activity of SOD in erythrocytes and GSH-Px in blood of BTW-treated groups mice were higher than that of DMH model mice. The PCNA-LI of preventive groups were lower than that of model group.These show the different extracts of BTW have the preventive and therapeutic effect on mice colorectal cancer induced by DMH. And the preventive effect is better than the therapeutic effect, the alcohol extract is more effective. This may depend upon the effect of BTW on protecting the activity of SOD and GSH-Px to scavenge free radicals in mice and inhibiting the proliferating activity of mucosal cells of large intestine.
Key words Radix pulsatillae;dimethylhydrazine;colorectal cancer;SOD;GSH-Px;PCNA
临床发现白头翁对肺癌及黑色素瘤等实体瘤具有一定的疗效［1］，在动物移植性肿瘤实验中已得到了证实［2］。本研究在化学致癌剂1，2-二甲肼(DMH)诱发小鼠大肠癌模型上观察了白头翁的防治肿瘤作用，并初步探讨其作用机理。
1 材料与方法
1.1 试验药物 白头翁(BTW)饮片购自杭州市新特药公司中药饮片分公司，产地为安徽滁县，经本校植化室鉴定。常法制备白头翁水煎剂和醇提液。
1.2 动物 ICR ♀小鼠体重18～22g，由浙江省实验动物中心提供。
1.3 试剂 1，2-二甲肼(DMH)、还原型谷胱甘肽(GSH)、二硫代双硝基苯甲酸(DTNB)等均为美国Sigma公司产品；三羟甲基氨基甲烷(Tris):Gibco BRL产品；邻苯三酚：江苏无锡市科技实验二厂产品；PCNA-PC10(IgG2a)单克隆抗体：丹麦DAKO公司产品；S-P试剂盒：福州迈新生物技术开发公司产品。
1.4 方法 120只♀小鼠随机分成6组，除对照组外，各组小鼠按20mg/kg剂量每周背侧颈部皮下注射一次DMH，共25周以诱发小鼠大肠癌［3］。治疗组于诱癌第18周时开始灌胃给药，其余均为全程给药，每天1次，每周连续6天，至25周末结束。动物每周称重1次以调整给药剂量。分别于实验第10、12、14、16周末每组各处死解剖1只小鼠，并于25周末处死全部剩余小鼠，取肛门以上8cm肠段沿结肠纵轴剖开，洗净，称肠重，并仔细观察记录有无肿瘤发生及发生数目、大小和位置，计算肿瘤发生率。将大肠标本置于10%福尔马林溶液中固定，以“席卷法”石蜡包埋，切片，HE染色，行常规病理学检查。红细胞SOD活力测定采用邻苯三酚自氧化法［4］进行。全血GSH-Px活力测定采用DTNB直接法［5］。大肠粘膜增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)检测采用免疫组化方法(S-P法)检测，步骤按试剂说明书进行，以PCNA标记指数(PCNA-LI)作为评价指标，PCNA-LI=(阳性细胞数/1000)×100%。
2 结果
2.1 一般情况 实验期间共死亡小鼠14只，其中DMH染毒组小鼠12只，绝大多数发生在诱癌8周内(9/12)，死前动物消瘦、衰竭，解剖未发现特殊病变和肿瘤，可能系注射DMH的毒性引起。
2.2 白头翁对诱癌小鼠大肠肠重、肿瘤发生数及发生率的影响 除空白对照组粘膜完整光滑，未发现大肠肿瘤外，各DMH染毒组小鼠肠粘膜均有不同程度的增厚，皱襞紊乱。诱发肿瘤均为隆起型，主要分布在距肛门以上8cm肠段内，尤以5cm处较集中，肿瘤发生数在0～19个范围内不等。肿瘤大小不一，多数直径约1～2mm，DMH模型组肿瘤直径相对较大。各DMH染毒组之间肠重无明显差异，白头翁醇提物组肿瘤发生数和发生率均明显少于DMH模型组，白头翁水煎剂15g/kg组肿瘤发生数亦较模型组显著减少，见表1。
表1 白头翁不同提取物对DMH诱癌小鼠肠重、肿瘤数和肿瘤发生率的影响 (
±s)
| 组 别 |
肠重(g) |
肿瘤数(个) |
肿瘤发生率(%) |
| 对照组 |
0.41±0.10 |
0 |
0(0/13) |
| 模型组 |
0.56±0.12＃＃ |
9.33±4.14＃ |
100(12/12)＃＃ |
| 水煎剂15g/kg |
0.47±0.09 |
4.08±3.29* |
83.3(10/12) |
| 水煎剂7.5g/kg |
0.48±0.08 |
6.14±3.72 |
100(14/14) |
| 醇提液15g/kg |
0.50±0.15 |
3.09±3.78* |
63.6(7/11)* |
| 治疗组15g/kg |
0.48±0.08 |
5.67±4.33 |
100(12/12) |
与DMH模型组比较 * P＜0.05；与空白对照组比较
# P＜0.05, ## P＜0.01(下同)2.3 病理学检查 10周末处死的1只DMH模型组小鼠大肠病理已出现Ⅰ级不典型增生，至14周时除空白对照组外各组均已出现Ⅰ-Ⅲ级不典型增生。诱癌第18周时首次发现有原位癌，至25周末各染毒组小鼠大多已诱发大肠癌。诱发的大肠癌在组织学上均为高分化腺癌，尤以乳头状腺癌多见，偶见粘液腺癌和管状腺癌。诱发肿瘤绝大多数为粘膜内癌，少数已进展为早期浸润癌(以突破基底膜为界)，突破粘膜肌层或侵入粘膜下层。其中DMH模型组浸润癌发生率为50%，明显高于白头翁用药组，提示白头翁不同提取物均有延缓肿瘤发生或减慢肿瘤进展的作用，见表2。
表2 白头翁不同提取物对DMH诱发小鼠大肠癌的影响
| 组 别 |
鼠数 |
大肠癌数(%) |
浸润癌数(%) |
| 空白对照组 |
13 |
0(0.0) |
0(0.0) |
| DMH模型组 |
12 |
12(100.0)＃＃ |
6(50.0)＃＃ |
| 白头翁水煎剂15g/kg |
12 |
8(75.0) |
1(8.3) |
| 白头翁水煎剂7.5g/kg |
14 |
12(85.7) |
2(14.3) |
| 白头翁醇提液15g/kg |
11 |
7(63.6) |
1(9.1) |
| 白头翁治疗组15g/kg |
12 |
11(91.7) |
2(16.7) |
2.4 白头翁对诱癌小鼠红细胞SOD活性及全血GSH-Px活性的影响 与空白对照组比较，DMH模型组小鼠红细胞SOD活性及全血GSH-Px活性显著下降，而白头翁不同提取物用药各组其酶活力较DMH模型组则均明显升高，但仍未达到正常水平。提示白头翁不同提取物对诱癌小鼠红细胞SOD活性及全血GSH-Px活性具有一定的保护作用，见表3。
表3 白头翁不同提取物对DMH诱癌小鼠红细胞SOD活性及全血GSH-Px活性的影响 (±s)
| 组 别 |
鼠数 |
红细胞SOD活性
(U/g*Hb) |
全血GSH-Px活性
(U/ml) |
| 空白对照组 |
13 |
3709±400 |
46.60±9.36 |
| DMH模型组 |
12 |
2650±589＃＃ |
30.91±5.56＃＃ |
| 水煎剂15g/kg |
12 |
3494±397 |
44.03±8.82 |
| 水煎剂7.5g/kg |
14 |
3523±393 |
38.92±6.24 |
| 醇提液15g/kg |
11 |
3547±286 |
42.20±7.51 |
| 治疗组15g/kg |
12 |
3373±447 |
37.41±6.65＃ |
2.5 白头翁不同提取物对诱癌小鼠肠粘膜PCNA表达水平的影响
2.5.1 染色结果 PCNA阳性染色定性于肿瘤细胞核内的棕黄色颗粒。正常粘膜PCNA阳性细胞分布稀疏，而癌组织中的阳性细胞分布则紊乱无规律，多为强阳性的片状分布。
2.5.2 PCNA-LI 空白对照组各小鼠肠粘膜组织PCNA-LI均小于25%，明显低于各DMH染毒组，DMH模型组PCNA-LI平均值较各白头翁预防用药组明显升高。而同一剂量的白头翁水煎剂(15g/kg)预防用药组PCNA-LI明显低于治疗组，见表4。
表4 白头翁不同提取物对诱癌小鼠大肠组织PCNA-LI的影响 (±s)
| 组 别 |
鼠数 |
PCNA-LI(%) |
| 空白对照组 |
13 |
17.54±3.48 |
| DMH模型组 |
12 |
49.58±12.84＃＃ |
| 白头翁水煎剂15g/kg |
12 |
32.58±6.89**＃＃ |
| 白头翁水煎剂7.5g/kg |
14 |
39.14±8.07*＃＃ |
| 白头翁醇提液15g/kg |
11 |
36.55±8.29**＃＃ |
| 白头翁治疗组15g/kg |
12 |
42.75±9.83＃＃△ |
与白头翁水煎剂15g/kg组比较 △ P＜0.053 讨论
本实验结果显示白头翁不同提取物对DMH诱发小鼠大肠癌均具有一定的预防和治疗作用。醇提物对大肠癌的预防作用相对较佳，这与白头翁提取物抗小鼠移植性肿瘤实验结果一致［2］。
本文进一步研究了白头翁防治DMH诱发小鼠大肠癌作用的机理，发现白头翁不同提取物均能显著提高诱癌小鼠红细胞SOD活力和血GSH-Px活力，证明可能与清除有害自由基有关。因DMH是一间接致癌剂，进入体内后可进一步被酶解或自发分解，产生醛、羟基离子及活性甲基化形式的重氮化合物，使大肠粘膜上皮细胞核DNA分子中鸟嘌呤甲基化，从而改变DNA分子结构，引起细胞癌变［6］。而细胞内SOD和GSH-Px等酶系统可有效清除自由基，起到防治肿瘤的作用。
PCNA是一种33～36KD的核蛋白(多肽)，系DNA多聚酶δ的辅助蛋白，是细胞DNA合成期必不可少的因子［7］。PCNA的出现明显与细胞增殖周期有关，并受生长因子的调节。在静止期细胞其含量很少；G1晚期开始增加，S期达到最高峰，G2期和M期则明显下降，说明其含量的变化与DNA合成过程一致。因此认为它能有效反映细胞增殖功能，是评估肿瘤恶性潜能的一个重要指标［8］。有关大肠癌中PCNA表达的研究，国内外都已有大量的文献报道［9，10］。本研究结果表明白头翁不同提取物在DMH诱癌小鼠大肠癌的发生过程中均可明显抑制肠粘膜细胞的增殖活性，减少粘膜细胞发生突变的机率，从而降低大肠癌的发生率，延缓肿瘤的进展。实验中还发现，白头翁水煎剂治疗性用药对大肠癌细胞增殖的抑制作用远不及早期预防性用药，说明白头翁水煎剂对大肠癌的预防作用优于治疗作用。
白头翁中含大量三萜皂甙及毛莨甙，后者在酶的作用下水解为原白头翁素(Protoanemonin)，而原白头翁素是白头翁的主要抗癌有效成分，但它在空气中极不稳定，很快又聚合为二聚体白头翁素(Anemonin)而失去抗肿瘤活性［11］。在抗癌药中这类属新型结构的化合物，可能对克服肿瘤细胞的多药耐药性(MDR)起一定作用，目前国内外这方面的研究较少。因此，对白头翁及其成分的进一步开发研究颇有必要，可望获得有效抗癌药。
注：浙江省卫生厅中医局课题
参考文献
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9 Yoshikawa R, Utsunomiga J. Cell proliferation kinetics are abnormal in transitional mucosa adjacent to colorectal carcinoma.Bri J Surg，1996；83∶36
10 陆爱平，李吉友.DNA损伤修复能力、p53蛋白及增殖细胞核抗原在大肠癌发生过程中的变化.中国肿瘤临床，1997；24(12)∶926
11 朱胃远，杨 云，陶 莹，等.原白头翁素的提取，合成及保存研究.中国科学技术大学学报，1987；17(3)∶336
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