乳腺肿瘤增殖细胞核抗原与DNA定量的关系
齐鲁肿瘤杂志 1998年第3期第5卷 基础研究
作者：朱建伟 张庆慧 刘爱如 田玉旺 李 红
单位：朱建伟 刘爱如 济南市(250014)山东省中医药研究所,张庆慧 李 红 济南市(250012)山东医科大学病理教研室；田玉旺 济南市(100021)北京市军区总医院病理科
关键词：乳腺肿瘤 增殖细胞核抗原 DNA定量
摘 要 目的 用单克隆抗体对乳腺肿瘤细胞的增殖细胞核抗原PCNA进行免疫组化标记，并与细胞内DNA定量，方法 直方图周期分析加以比较。结果 PCNA阳性细胞的分布在良性肿瘤及各级乳腺癌不同，其量的表达随恶性程度的增高而增高。经X2检验，P＜0.025，差异显著。结论 PCNA中度和高度表达组的DNA含量及异倍体率高于低表达组(P＜0.05)，但不是明显递增，而是在中度表达组中趋于最高。
Correlation of Proliferative Cell Nuclear Autigen to DNA Content in Breast Tumor
Zhu Jianwei,Zhang Qinghui,Liu airu,et al
(Dep.of pathology,shandong Institute of Traditional Chinese Medicinee and Materia,Jinan 250014)
Abstract Proliferative cell nuclear antigen(PCNA)were labeled by monoclonal anti-body PC10.The results showed that distributive pattern of PCNA positive cells were different between benign and malignant trmors.The expression of PCNA increased with the advance of malignant grading significantly(P＜0.025).DNA content in medium and high expression groups were higher than these in low expression group.
Key words Breast tumor PCNA DNA content.
增殖细胞核抗原(Proliferation cell nuclear antigen,PCNA)又叫细胞周期旦白(Cyclin)是只在进入增殖周期的细胞中才有的一种分子量36KD的抗原物质。被认为对DNA复制的调节起重要作用，并直接参与了真核细胞的DNA合成。它在G1(DNA合成前期)后期开始增多，S期(DNA合成期)达高峰，在G2期(DNA合成后期)和M期(有丝分裂期)明显减少。在G0期(静止期)和G1早期则没有表达［1］。DNA是细胞增殖必须的遗传物质，在正常人体细胞中的G0和G1早期均为二倍体，进入周期后，既在G1后期DNA开始少量复制，M期达高峰，G2期则停止。此时DNA含量由二倍体变为四倍体并进入有丝分裂期，分裂期结束后，成为两个二倍体细胞。因此理论上讲PCNA和DNA这两种分子物质随细胞周期时相变化而增多或减少的规律，具有一致性。但在恶性肿瘤时，细胞的功能代谢发生了很大改变，增殖周期内各种物质的关系有可能被打乱，在量的表达和分布上失去平衡。为此我们对乳腺肿瘤细胞内PCNA的表达及其与DNA定量的关系进行了观察。
1 材料与方法
1.1 临床病理材料
1995年4月～1996年1月山东医科大学附属医院手术切除的新鲜乳腺肿瘤组织60例。于肿瘤中央无坏死区取材，先印片并将印片置95%的酒精中固定10分钟后取出，以备DNA染色之用。然后将组织常规包埋，切片行HE和PCNA免疫组化染色。
1.2 免疫组化染色
1.2.1 试剂PCNA单克隆抗体PC10及LSAD试剂盒均为Sigma公司产品。
1.2.2 染色过程：(1)石腊切片常规脱蜡入水。(2)3%H2O2作用5分钟。(3)蒸馏水冲洗3次，每次5分钟。(4)正常血清30分钟，室温，滴加一抗1：100，4℃过夜。(5)PBS洗3次，每次5分钟。(6)生物素标记的lgG1：200，37℃，30分钟。(7)PBS洗3次，每次5分钟。(8)SP1：200，37℃，30分钟。(9)PBS洗3次，每次5分钟。(10)DAB显色，常规脱水封片。
1.2.3 结果判断 细胞核呈棕黄色反应的为阳性细胞，每例随机观察10个高倍视野，每个视野计数100个细胞中的PCNA阳性细胞数，根据阳性细胞在所观察细胞总数中所占的比例，定为3个等级：阳性细胞占细胞总数30%以下的为低度表达，阳性细胞占细胞总数30%～70%的为中度表达，阳性细胞比例70%以上的为高度表达。如果PCNA着色情况在同张切片中有深有浅，则不加区分，均计为阳性。
1.3 DNA定量
组织印片行Feulgen-Rossenbeck改良法DNA染色［2］。然后用国产CMIAS-B真彩色图象分析仪进行细胞内DNA定量。每片随机测100个瘤细胞和30个淋巴细胞，系统自动计算细胞核积分光密度(Integral Optical Density,IOD)，其值代表细胞核DNA相对含量。以淋巴细胞做为二倍体细胞对照，根据二倍体细胞DNA上限值计算机自动统计分析二倍体、三倍体、四倍体、五倍体细胞占各例病变细胞的百分比，并绘制组方图。
1.4 统计 美国SAS软件包对PCNA免疫组化结果与DNA各参数及病理学分级进行比较。统计方法为X2检验、等级相关和方差分析。
2 结果
2.1PCNA的表达及其与病理学分级的关系
60例标本中有7例因蜡块组织过少或染色过程中脱片而缺失。剩余53例合格标本中有良性病变2例，乳腺癌51例，其中Ⅰ级癌10例，Ⅱ级癌29例，Ⅲ级癌12例。所有病例均有不同程度的阳性PCNA表达。光镜下可见PCNA阳性染色定位于细胞核内，胞浆多呈阴性反应。Ⅲ级浸润性导管癌中有2例有部分细胞胞浆着色，但胞浆着色的细胞如果不同时有胞核着色则不按阳性细胞计入。PCNA表达在实质细胞和间质细胞中均可见到，但以实质细胞多见。2例乳腺良性病变的PCNA均为低度表达，阳性细胞主要分布于靠基底膜的上皮细胞中或肿瘤的周边部位。乳腺癌的PCNA表达方式则较为复杂，一般来说Ⅰ级癌的表达率低，阳性细胞分布于肿瘤周边部位，类似良性病变。Ⅱ级癌和Ⅲ级癌的表达率增高，阳性细胞散在于癌巢各部位，或成片状分布，在肿瘤向周围浸润的前沿区，肿瘤细胞PCNA的阳性率更高，乳腺癌的细胞大小不均匀，PCNA在各种大小的细胞中均可有阳性反应，核大畸形明显的细胞PCNA阳性率似乎不如中等大小的细胞(见表1)。
表1 PCNA表达与乳腺癌分级
| |
低度表达 |
中度表达 |
高度表达 |
总计 |
| Ⅰ级癌 |
5 |
5 |
0 |
10 |
| Ⅱ级癌 |
3 |
21 |
5 |
29 |
| Ⅲ级癌 |
0 |
11 |
1 |
12 |
| 总计 |
8 |
37 |
6 |
51 |
x2=13.26 P＜0.025
2.2 PCNA的表达与DNA的关系
以PCNA的表达程度为分组依据时DNA各参数的变化情况见表2。
表2 PCNA表达程度与DNA的关系
| |
DI |
倍体含量百分比(%) |
| 2C |
3～4C |
5C |
＞5C |
| 低度表达 |
1.8663±0.678 |
51.745±11.22 |
39.45±15.244 |
4.76±7.474 |
4.3±6.2 |
| 中度表达 |
2.1442±0.564 |
35.83±18.232* |
35.48±14.621 |
10.07±5.28* |
12.72±9.826** |
| 高度表达 |
2.1172±0.478 |
35.73±20.164* |
42.15±17.78 |
5.795±4.665 |
14.78±8.88** |
与低表达组相比 *P＜0.05,**P＜0.01
PCNA中度表达和高度表达组的DNA指数(DNA Index,DI)较低表达组高，但差异无显著意义(P＞0.05)，2C含量百分比在低表达组高于其余两组。中度表达组和高表达组的高倍体(5C和＞5C)也都高于低表达组，但不是递增，而是在中表达组最高，相关分析显示PCNA的表达与DI和＞5C百分比轻度相关，相关系数和P值分别为r=0.36082，P＜0.01和r=0.33099 P＜0.05，与2C百分比轻度负相关，r=-0.32081 P＜0.05。 3 讨论
PCNA是细胞增殖过程中的重要物质，在G1早期和S期诱导DNA合成［3］。对PCNA的研究和认识比DNA要晚得多，但发展很快，目前PCNA的氨基酸序列、基因定位、基因结构特征和生长调节机制都已得到阐明，单克隆抗体19F4、19F2、和PC10已制备成功并用以检测正常及瘤细胞的增殖分数和所处周期。用上述单克隆抗体对乳腺肿瘤的PCNA检测也已有文献报道，但较少而且结果较为混乱［4，5］。
我们的研究表明，乳腺癌PCNA的表达与病理学分级相关，差异主要在Ⅰ级与Ⅱ～Ⅲ级癌上，这种差异反映在分布形式和表达程度上。被复上皮和腺上皮在人体细胞中属于再生能力较强的不稳定细胞，在正常情况下就有一定数量的细胞增生，以补充衰老死亡的细胞，这些处于增殖状态中的周期细胞都位于靠近基底膜的生发层中，离基底膜越远则细胞越成熟，增殖活性越低，我们的研究中良性肿瘤和Ⅰ级癌及少数Ⅱ级癌仍保留有正常组织的这种特征，PCNA阳性细胞靠近基底膜或在肿瘤的周边部位，只是阳性细胞数目增多。在多数Ⅱ级癌和Ⅲ级癌，增殖细胞的分布失去了这种特征。增殖期与非增殖期细胞无规律地混杂在一起或在癌巢中成片分布，远离基底膜的细胞群中也有大量的增殖细胞。PCNA的表达程度在Ⅰ级癌为低度或中度表达，在Ⅲ级癌为中度或高度表达，在Ⅱ级癌则各级表达均有。Throud等的研究发现［6］，目前乳腺癌病理分级的中分化癌中，实际上包括了生物学特性明显不同的肿瘤［6］，PCNA在Ⅱ级乳腺癌的表达表现出较大的离散趋势，可能也是造成这种生物学特性不同的物质基础之一。
PCNA是诱导和参与DNA合成的物质，正常时都在G1后期开始合成，在S期达高峰，因此，两者在周期内的变化规律应有一致性，我们将PCNA分析的各种参数做了比较以进一步了解两者在乳腺癌中的关系，研究中发现，乳腺癌中一些核大，深染，畸形明显的细胞，DNA含量一般都明显增高，但是PCNA不一定是阳性，说明DNA含量高的细胞并非都处于增殖周期中。PCNA阳性细胞，一般都是中等大小，DNA含量也是中度增高，PCNA中度、高度表达组的DI、5C和＞5C细胞百分比都较低表达组高，但没有明显的递增关系，而趋向于在中表达组中最高，其中5C细胞百分比最为明显，与其它两组均有显著差异(P＜0.05)。
相关分析显示，PCNA与DI、5C百分比、＞5C百分比仅有轻度相关趋势，但不明显，说明乳腺肿瘤中PCNA与DNA在细胞周期中的变化并不完全同步。关于DNA含量及高倍体细胞在PCNA中度表达组最高这一现象，是否可以这样解释，在每一个具体肿瘤克隆中，其单个细胞内DNA的增高由于某种内在机制存在一个限制范围。恶性潜力较大，DNA含量还未达到该限制范围的细胞增殖活性保持旺盛状态，PCNA为高度表达。而DNA含量较高的细胞达到或接近此范围，其DNA复制和增殖就减慢或停止，因此DNA含量最高的细胞群中PCNA的表达反而有所减少，表现为中度表达，形态学上核大畸形最明显的细胞PCNA表达率不如中等大小的细胞似乎也说明了这一点。但也可能有别的解释。Cormick和Hall认为PCNA在S期DNA合成过程中是一种必须的但不是充分的条件，而且可以被生长因子所诱导，因此有可能被非合成期细胞所表达［5］。Baserga等人则认为PCNA的半衰期较长，约20个小时，而细胞周期仅有10～16个小时，因此有些细胞在分裂期过后仍为阳性表达［7］，这些都是造成PCNA与DNA表达不同步的可能原因。而另一些人的研究则显示PCNA表达与DNA定量有良好的相关性，不存在什么不同步的问题［8，9］。
总之，PCNA的检测是较晚发展起来的一种有潜在应用价值的肿瘤增殖动力学研究方法。对它的研究相对较少。PCNA在乳腺肿瘤发生发展过程中起的作用及其对诊断预后意义的认识还存在不少的空白和争议，有关的报道比较混乱。我们希望通过PCNA在各级乳腺癌中的表达及其与DNA分析、细胞周期等的关系的研究，有助于澄清一些学术上的争议，在分子水平上增加对肿瘤本质的认识。至于PCNA能否协同DNA定量分析，提高对乳腺癌预后估计的可靠性，尚需通过进一步随访才能得出结论。
参考文献
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[3] Rodrigo B,Heather MB.Existense of two popula-tions of cyclin/proliferating cell nuclear antigen during the cell cycle:Association with DNA replication sites.J cell Biol,1987,105:1549.
[4] Tahan SR,Neubery DS,Dieffenbach A,et al.Predi-ction of early relapse and shortened survival in patients with breast cancer by proliferating cell nuclear antigen score.Cancer,1993,71:3552.
[5] Cormick,DM.Hall DA.The complexities of pro-liferating cell nuclear antigen.Histopathology,1992,21:591.
[6] Throud E,et al.Primary breast cancer.Flow cyto-metric DNA pattern in relation to clinical and histopathologic characteristics.Cancer,1986,57:808.
[7] Baserga R.Growth regulation of the PCNA gene.J Cell Sei,1991,98:433.
[8] Torben H,Grete KJ.Proliferating cell neuclear antigen in breast carcinomas.Virchow Archiv,1994,424:39.
[9] Siitonen SM,Isola JJ,Rantala Is,et al.Intratumor variation in cell proliferation in breast carcinoma as a determined by anti-PCNA monoclonal antibody and automated image analysis.Am J Clin Pathol,1992,99:226.
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