胃癌端粒酶活性检测的临床意义

中华实验外科杂志 1999年第5期第16卷 论著

作者：马晋平　詹文华　蔡世荣　郑章清　何裕隆　汪建平

单位：510080　广州，中山医科大学附属第一医院胃肠胰腺外科

　　关键词： 端粒酶；胃癌；诊断

　　【摘要】　目的　探讨端粒酶在胃癌组织中的活性及其临床意义。方法　应用银染TRAP方法检测94例胃癌组织、12例胃腺瘤、9例胃溃疡和58例癌旁正常胃粘膜中端粒酶活性。结果　94例原发胃癌组织中检出端粒酶阳性81例，阳性率为86.2%。正常粘膜无1例检测到端粒酶表达，12例胃腺瘤有1例表达端粒酶阳性，在9例胃溃疡组织中有1例检测到端粒酶表达，12例胃腺瘤有1例表达端粒酶阳性，在9例胃溃疡组织中有1例检测到阳性端粒酶表达。胃癌与正常粘膜组端粒酶表达率差异有显著性(P＜0.001)。端粒酶活性与肿瘤大小、分化程度、浸润深度、淋巴结转移和TNM分期无明显相关(P＞0.05)。结论　测定胃癌端粒酶活性对胃癌的诊断有一定意义。

Telomerase activity in human gastric carcinomas

MA Jinping,ZHAN Wenhua,CAI Sirong，et al.

(Department of Gastrointestinal and Pancreatic Surgery,The First Affiliated Hospital,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510080)

　　【Abstract】Objective To study the telomerase expression in gastric carcinomas and the clinical implications.Methods Telomerase activity was detected by a non-isotopic PCR-based TRAP assay (telomeric repeat amplification protocol) in tissue samples from 94 gastric carcinomas, 58 normal tissues, 12 gastric adenomas and 9 gastric ulcer lesions.Results None of the normal tissues exhibited telomerase activity. In contrast, 81 out of the 94 patients with cancers were positive for telomerase expression (P＜0.001), 1 of 12 with gastric adenomas and 1 of 9 gastric ulcer also were positive for telomerase expression. The incidence of telomerase activity in gastric carcinoma tissues was not correlated to tumor size, differentiation, tumor invasion in depth, lymph node metastasis or TNM stage (P＞0.05).Conclusion Telomerase might be a good diagnostic marker for the diagnosis of gastric carcinoma.

　　【Key words】 Stomach neoplasm Telomerase TRAP

　　我们用银染TRAP(telomeric repeat amplification protocol)方法检测胃癌组织中端粒酶活性，旨在探讨胃癌组织中端粒酶表达状况及临床意义，结果报道如下。

　　材料与方法

　　1. 标本来源　94例胃癌组织、12例胃腺瘤、9例胃溃疡及58例癌旁正常粘膜均取自我院从1997年2月～1998年4月外科手术及经胃镜切除的标本。组织标本经液氮转运到-80℃低温冰箱储存待用。

　　2. 组织提取物的制备　取组织标本约50～100mg，用液氮在高压消毒过的研钵中研成粉末，转入2ml玻璃匀浆器，加入200μl冷的裂解缓冲液(10mmol/L Hepes-KOH pH 7.5, 1.5mmol/L MgCl₂, 10mmol/L KCl, 1mmol/L DTT)，悬浮液在0℃的冰水中孵育30分钟，16，000r/min高速离心30分钟(4℃)，收集上清液，-80℃保存备用。

　　3. 端粒酶检测　采用TRAP法检测端粒酶活性^［1］，反应体系包括20mmol/L Tris-HCl (pH8.3), 1.5mmol/L MgCl₂, 63mmol/L KCl, 0.005% Tween 20, 1mmol/L eGTA, 0.1mg/L BSA, 50mmol/L dNTP, 0.1μg TS引物(5′-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3′)，0.1μg CX引物(5′-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA-3′)，2U Taq酶，加组织提取液6μg。 30℃反应30分钟，之后立即转入94℃，进行31个循环扩增，参数为：94℃30秒， 50℃30秒， 72℃1.5分钟。最后1个循环在72℃继续反应10分钟。PCR产物进行12.5%非变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳，100伏，1.5小时或直到溴酚蓝跑出即停止电泳。然后进行常规硝酸银染色。

　　4. 统计学方法　应用SAS软件包χ²检验和Fisher精确检验法统计阳性表达率差别。

　　结　　果

　　1. 胃癌组织端粒酶表达的检测结果　间隔6bp特异性阶梯信号表示端粒酶表达阳性。94例原发胃癌组织中检出端粒酶阳性81例，阳性率为86.2%。相应患者的正常粘膜无1例检测到端粒酶表达，12例胃腺瘤有1例表达端粒酶阳性，9例胃溃疡组织中1例检测到阳性端粒酶表达。胃癌与正常粘膜组端粒酶表达率差异有显著性(P＜0.001)。

　　2. 胃癌组织端粒酶表达与临床病理参数的关系　根据肿瘤大小、分化程度、浸润深度、淋巴结转移和TNM分期进行分组，各组端粒酶活性情况见表1。经统计学分析，各组端粒酶阳性表达率差异均无显著性(P＞0.05)。

表1　胃癌端粒酶表达与临床病理参数的关系

注：^*合并T1和T2与T3和T4后，两组间比较；^**合并Ⅰ和Ⅱ与Ⅲ和Ⅳ后，两组间比较

　　讨　　论

　　目前已经在广泛的人类肿瘤组织中检测到了端粒酶活性^［2］。在消化系恶性肿瘤中，如食管癌、胃癌、肝细胞癌及大肠癌组织中端粒酶也呈较高的阳性表达。说明端粒酶的阳性表达与人类恶性肿瘤的发生有着非常密切的关系。因此，端粒酶被认为是目前较理想的广谱肿瘤标记物。

　　本研究中94例胃癌组织中端粒酶阳性表达的检测结果为81/94(86.2%)，这一结果与Shay^［3］报道的人类肿瘤平均端粒酶阳性率相近，说明端粒酶也是胃癌较理想的肿瘤标记物。本研究中约13.8%的胃癌组织未检测到端粒酶阳性表达，可能是因为：(1)存在“端粒酶旁路”机制所致^［4］。(2)可能存在非“永生化”肿瘤细胞所致。在5例早期胃癌、12例胃腺瘤和9例胃溃疡标本中分别有1例检测到端粒酶活性，对这样的标本进行了必要的重复检测及稀释后检测，其结果均一致，所以不可能是人为的假阳性现象。说明端粒酶可以在胃癌发生的早期甚至癌前疾病中表达，这对于胃癌的早期诊断可能是十分重要的。上述结果提示，端粒酶在胃癌的发生过程中可能起着十分重要的作用，将是一种较理想的胃癌肿瘤标志物。

　　端粒酶的活化与恶性肿瘤临床病理参数的关系，目前的研究结果颇不一致。Maruyama则认为端粒酶表达是胃癌发生的早期事件。Hiyama的研究显示，端粒酶表达阳性的肿瘤常常体积较大并有较高的淋巴结转移率，而且术后生存时间也较表达阴性的患者低。Ahn认为胃癌中端粒酶表达与患者的年龄、性别、肿瘤的分期、组织学分级、DNA倍体及K-ras基因突变均无关，也与术后生存率无关。Brown认为在大肠癌中端粒酶的活性与肿瘤的临床分期及p53的表达不相关。本研究结果显示，胃癌组织中端粒酶表达与肿瘤大小、分化程度、浸润深度、淋巴结转移和TNM分期无关。随着研究的深入，端粒酶表达与胃癌的生物学行为的关系将得到进一步的阐明。

　　本课题为“中山医科大学211工程重点学科建设项目”(No.98097)和“广东省医学科研基金”(A 1999147)资助项目

　　参考文献

　　1　Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cell and cancer. Science, 1994, 266:2011-2015.

　　2 Hiyama K, Hiyama E, Ishioka S, et al. Telomerase activity in small-cell and non-small-lung cancer. J Natl Cancer Inst, 1995, 87:895-902.

　　3 Shay JW, Bacchetti S. A survey of telomerase activity in human cancer. Eur J Cancer, 1997, 33: 787-791.

　　4 Zakian VA. Life and cancer without telomerase. Cell, 1997, 91:1-3.

(收稿：1998-05-11　修回：1999-06-05)