蝎毒抗癌多肽对放疗后肝癌小鼠瘤重和一般状况影响的初步观察

中华放射医学与防护杂志 2000年第5期第20卷 基础研究

作者：孔天翰　魏玲　韩雪飞　董伟华

单位：孔天翰　韩雪飞　董伟华（450052　郑州，河南医科大学生物毒素中心）；魏玲（山东省肿瘤防治研究所）

关键词：蝎；毒素；肝肿瘤；放射治疗

　　【摘要】　目的　观察蝎毒抗癌多肽(APBMV)与放疗(RT)合用对肝癌小鼠的作用。方法　取H₂₂带瘤小鼠100只，采用肿瘤生长抑制率(IR)、白细胞计数和血红蛋白含量、SOD活力、LPO含量测定及脾重指数(SI)等指标，观察不同剂量的APBMV与放疗合用后上述指标的变化。结果　放疗后6 d及9 d，RT与APBMV合用后瘤重明显降低，IR最高达78.29%与70.45%(与RT组和APBMV组比较，P＜0.05，或P＜0.01)，白细胞计数和SI较RT组显著升高(P＜0.05，P＜0.01)；血红蛋白含量测定结果无明显差异；RT组SOD活力最低，LPO含量最高(与对照组比较P＜0.05，P＜0.01)，RT+APBMV高剂量组SOD活力明显提高，LPO含量显著降低(P＜0.01)，接近空白对照水平。结论　APBMV与放疗合用对H₂₂的抑制作用比单纯放疗和单用APBMV增强，APBMV并能减轻辐射对带瘤小鼠机体的损伤。

Primary observation on the effect of APBMV on tumor weight and general physical condition of hepatoma 22-bearing mice after radiotherapy.

KONG Tianhan,WEI Ling,HAN Xuefei,et al.

　　（Center of Venom and Biological Toxins,Henan Medical University,Zhengzhou 450052,China）

　　【Abstract】 Objective To observe the effect of antineoplastic polypeptide from Buthus martensii venom (APBMV) combined with radiotherapy on hepatoma-bearing mouse. Methods Hundreds H₂₂-bearing mice were used in this experiment.The tumor growth inhibiting rate (IR%),WBC count,hemoglobin content,activity of superoxide dismutase (SOD),level of lipid peroxide (LPO) and spleens index (SI) were used as the parameters.After radiotherapy (RT) or after administration of different dosage of APBMV combined with RT,the changes of these parameters were observed. Results On the 6th and 9th day after radiotherapy,the tumor weights decreased after administrating APBMV combined with RT,in which IR were 78.29% and 70.45%,respectively (comparing with RT and APBMV group,P＜0.05 or P＜0.01).In RT+APBMV group,WBC count and SI were also higher than those of the RT group (P＜0.05,P＜0.01 ).The results of measurement of hemoglobin content in peripheral blood indicated that there were no differences (P＞0.05) among all groups.SOD activity was the lowest and LPO level was the highest in RT group (comparing with the control group,P＜0.05,P＜0.01).Combining the high dosage of APBMV with RT to treat H₂₂-bearing mice,SOD activity increased and LPO level decreased evidently (comparing with RT group,P＜0.01)and approached the levels of the control group. Conclusion The inhibiting effect of the combining therapy (APBMV combining with RT)on H₂₂ was stronger than radiation or APBMV alone.APBMV can also antagonize radiation injury on H₂₂-bearing mice.

　　【Key words】 Scorpion; Venom; Liver neoplasma; Radiotherapy

　　全蝎是我国传统医药中常见的一味药物，全蝎的药用作用多为其蝎尾分泌的蝎毒所为。近10年来，作者对河南产的东亚钳蝎蝎毒及其分离组分抗肿瘤作用进行了研究，发现其对多种肿瘤细胞有生长抑制作用^［1，2］，并将从蝎毒中分离出的抗肿瘤有效成分命名为蝎毒抗癌多肽(antineoplastic polypeptide from Buthus martensii venom,APBMV)。APBMV对数种动物移植性肿瘤有明显的抑制作用，APBMV对小鼠肝癌H₂₂发挥较好疗效的同时，带瘤小鼠外周血白细胞计数和脾脏指数与对照组相比均无明显变化^［3］。本文作者仍采用H₂₂为实验动物模型，观察APBMV与放疗合用对H₂₂带瘤小鼠的实验治疗效果以及APBMV可能存在的抗辐射损伤作用。

　　材料和方法

　　1.材料

　　(1)动物：昆明种小鼠，雄性，6～8周龄，(20±2) g,河南省动物实验中心提供。

　　(2)瘤株：小鼠肝癌H₂₂细胞株，由河南省医学科学研究所引进。

　　(3)APBMV系从河南东亚钳蝎蝎毒中分离。分离方法依本实验室的常规方法进行，HPLC法分析监测分离效果。经冷冻干燥后的APBMV-20℃保存，用前生理盐水配制成所需的浓度。

　　(4)照射条件：⁶⁰Co γ射线治疗机，源皮距80 cm，照射面积15 cm×15 cm，一次全身照射。照射剂量率为0.52 Gy/min，总剂量为7 Gy。

　　2.方法

　　(1)H₂₂带瘤动物的移植和接种^［4］：取传代6～7 d的H₂₂带瘤小鼠，无菌抽取乳白色腹水，0.2%台盼蓝染色镜检细胞活力在96%以上。以灭菌生理盐水稀释瘤液至1×10⁷/ml的细胞悬液，每只小鼠右侧腋部皮下接种0.2 ml。

　　(2)实验分组及照射、给药方法及途径：接种H₂₂细胞24 h后的小鼠随机分为5组，每组20只。①空白对照组：等体积生理盐水腹腔注射，不行放疗；②放疗组(RT)：行放疗，同时腹腔注射生理盐水；③APBMV治疗组：APBMV 0.06 mg/kg腹腔注射，不行放疗；④RT+APBMV低剂量组：放疗，APBMV 0.03 mg/kg腹腔注射；⑤RT+APBMV高剂量组：放疗，APBMV 0.06 mg/kg腹腔注射。瘤液接种24 h后，带瘤小鼠按上述分组给予相应药物，再经12 h，行放疗，放疗后每天给药1次。各组小鼠分别于放疗后给药的第6天和第9天各处死10只，观察相应的指标。

　　(3)观察指标：①肿瘤生长抑制率：带瘤小鼠处死后，解剖剥离瘤块，称瘤重，计算肿瘤生长抑制率(inhibiting rate,IR)^［4］；②外周血白细胞计数：剪尾采血20 μl/只，按常规方法计数；③血红蛋白含量测定：采用国际上公认的氰化高铁血红蛋白分光光度法；④脾重指数：取脾脏称重，求脾重指数(spleen index,SI;SI=脾脏重量/体重)，结果以mg/10g体重表示：⑤SOD活性测定：采用硝酸盐形成法；⑥LPO含量测定：采用硫代巴比妥酸(TBA)显色法。

　　(4)统计学处理：结果以±s表示，t检验求出P值。

　　结　　果

　　1.APBMV对肝癌小鼠放疗后瘤重的影响：⁶⁰Coγ射线照射后第6天和第9天，4个实验组的瘤重均低于对照组(P＜0.01)，以RT+APBMV高剂量组瘤重降低最明显，放疗后第6和第9天时IR分别为78.29%和70.45%，对肿瘤的抑制作用显著好于RT组和APBMV组(P＜0.05或P＜0.01)；放疗后第9天，RT+APBMV低剂量组的瘤重与RT组和APBMV组比较差异具有非常显著性(P＜0.01，见表1)。

　　2.APBMV对放疗后H₂₂带瘤小鼠白细胞总数和脾重指数的影响：表2数据显示，⁶⁰Coγ 射线照射后第6天及第9天，行放疗的各组带瘤小鼠白细胞计数和SI均低于对照组(P＜0.01)，尤以RT组最低，其与RT+APBMV两剂量组比较，差异具有显著性(P＜0.05)。APBMV单独应用时，带瘤小鼠白细胞总数和SI维持正常。

　　3.APBMV对放疗后带瘤小鼠外周血血红蛋白含量的影响：无论放疗后第6天抑或第9天，实验各组及其对照组之间小鼠血红蛋白含量均无显著差异(P＞0.05)。

　　4.APBMV对放疗后H₂₂带瘤小鼠SOD活力和LPO含量的影响：放疗后第6及第9天，RT组SOD活力最低，其与RT+APBMV两剂量组及对照组比较，差异具有非常显著性(P＜0.01)；RT+APBMV高剂量组和APBMV组的SOD活力最高，超过对照组水平，但P＞0.05。放疗各组LPO含量均高于对照组，其中以RT组LPO值最高，其与RT+APBMV高剂量组及对照组比较，差异具有非常显著性(P＜0.01)，RT+APBMV高剂量组和APBMV组的血清LPO含量最低，接近对照组水平(P＞0.05，见表3)。

　　讨　　论

　　放射治疗是恶性肿瘤的传统疗法之一，也是肝癌患者常选用的疗法。放疗引起的严重造血功能抑制和机体其他功能的损伤却严重影响了放疗的治疗效果。本研究将APBMV与放疗合用，观察APBMV对放疗后肝癌小鼠瘤重以及对放疗引起的造血功能抑制和脂质过氧化等机体状况的影响。作者以往的研究表明，APBMV对多种肿瘤细胞和动物移植性肿瘤有生长抑制作用，APBMV单独使用对H₂₂的抑瘤率最高达40.30%^［3］。与以往的研究结果相同，于本实验观察的两个时间点，APBMV单独应用时，对H₂₂均保持较稳定的抑制作用。APBMV与7 Gy ⁶⁰Co γ射线联合应用后第6天和第9天，H₂₂带瘤小鼠的瘤重显著下降，IR最高达78.28%，APBMV与RT合用对H₂₂的疗效明显好于单用RT和单用APBMV，尤其是放疗后第9天时，RT组的IR由第6天时的66.77%降至47.87%，而RT+APBMV两剂量组IR仍保持在61.17%和70.45%，与RT组比较差异具有非常显著性(P＜0.01)。说明射线对肿瘤的抑制作用已逐渐减弱时，APBMV与RT合用组仍维持较强的肿瘤抑制作用，提示APBMV可能增加了肿瘤组织对射线的敏感性，或是发挥了其本身对肝癌H₂₂细胞的直接毒性作用，增强了射线对肿瘤细胞的杀伤效应。

表1　APBMV对放疗后小鼠肝癌H₂₂瘤重的影响

组别	APBMV 　　(mg/kg)	n	第6天		第9天
			瘤重(g.±s)	IR(%)	瘤重(g.±s)	IR(%)
对照	0	10	0.304±0.095	-	0.846±0.171	-
APBMV	0.06	10	0.196±0.023	36.45	0.532±0.069	38.51
RT	0	10	0.101±0.030*	66.77	0.441±0.076*	47.87
RT+APBMV	0.03	10	0.090±0.028*	70.39	0.320±0.073*＃＃	62.17
RT+ATBMV	0.06	10	0.066±0.027*#	78.28	0.250±0.084*##	70.45

　　注：与对照组比，^*P＜0.01；与RT和APBMV相比，^＃P＜0.05，^##P＜0.01

表2　APBMV对放疗后H₂₂带瘤小鼠白细胞计数和脾重指数的影响(±s)

　　注：与对照相比，^*P＜0.01；与RT相比，^#P＜0.05

表3　APBMV对放疗后H₂₂带瘤小鼠SOD活力和LPO含量的影响(±s)

　　注：与对照相比，^*P＜0.01；与RT相比，^#P＜0.01

　　外周血白细胞对电离辐射损伤作用高度敏感，其数量与质量的变化可反映骨髓组织的功能状态，是评价辐射损伤的重要指标之一。保护骨髓，防止白细胞降低是提高放疗效果的重要因素。本文结果显示，APBMV组带瘤小鼠的白细胞总数维持正常，而无论放疗后第6天或第9天，放疗各组H₂₂带瘤小鼠白细胞计数以RT组最低，APBMV与RT合用组的白细胞计数显著回升，高于RT组(P＜0.01)，表明APBMV具有一定程度的升白细胞和骨髓保护作用。陈幸华等人^［5］采用5 Gy ⁶⁰Co γ射线源一次性全身照射，小鼠骨髓基质细胞(CFU-F)数量显著下降，至放射后第14天仍未达正常组水平；邹仲敏等人^［6］的研究发现，6 Gyγ射线照射后小鼠骨髓造血细胞发生凋亡，认为射线损伤造血功能的主要途径之一是诱导细胞发生凋亡。本实验中观察到的APBMV具有一定程度骨髓保护作用的机制有待进一步研究。

　　脾脏的主要成分是对射线高度敏感的淋巴细胞^［7］，脾脏指数(SI)是反映电离辐射损伤较为敏感的指标。脾脏的重量主要取决于脾中的造血集落，脾脏的重量的明显下降，提示脾中造血集落的大幅度减少，即机体存活造血干细胞数量的明显降低。本实验结果表明，APBMV组带瘤小鼠的SI保持正常水平，APBMV与RT合用两组的SI亦高于RT组(P＜0.05)；说明APBMV可对抗辐射所引起的SI降低，对脾脏具有一定的保护作用。该保护作用是否由于APBMV减少了脾脏多能造血干细胞(CFU-S)的辐射损伤，抑或是促进了残存CFU-S增殖，有待深入研究证实。此外，由于脾脏也是体内重要的免疫器官，APBMV对脾脏的保护作用，可能有利于增强自身的免疫功能，提高辐射耐受力，同时也增强对肿瘤的抑制作用。

　　Akita等人的实验研究证明，电离辐射可导致体内自由基产生过多，脂质过氧化物LPO增加^［8］。通过LPO含量测定，能反映机体脂质过氧化反应程度和自由基含量，间接反映受照射细胞的损伤程度。电离辐射在引起LPO含量明显增加的同时，SOD活力下降也非常明显^［9］。提高SOD活力能达到清除自由基及抗辐射损伤的目的。本实验结果显示，APBMV组SOD活力和LPO水平均略高于对照组值(P＞0.05)；在放疗后第6天和第9天，RT+APBMV高剂量组LPO水平明显低于RT组(P＜0.01)，已恢复到对照组水平；放疗后以RT组血清SOD活力下降最明显，RT+APBMV高剂量组H₂₂带瘤小鼠SOD活力明显提高(与RT组比较，P＜0.01)。以上结果说明，APBMV能加快清除照射后产生的自由基，抑制辐射引发的脂质过氧化作用，拮抗放疗引起的SOD活力下降，提高机体的抗氧化能力。周红宁等人观察到，应用不同剂量γ射线照射后，小鼠移植性肝癌的潜伏期延长，小鼠血清SOD含量显著升高，对辐射产生的有害损伤如自由基进行清除，也抑制了肿瘤的形成与生长^［10］。APBMV可能也是通过升高小鼠血清SOD水平，增强放疗对小鼠肝癌H₂₂的抑瘤效果，同时也一定程度的拮抗了辐射损伤。

　　基金项目：河南省计委重大科技攻关项目基金资助项目(96-59)

参考文献

　　1，董伟华，臧梦维，孔天翰，等.河南马氏钳蝎蝎毒对Eca109细胞的杀伤及生长抑制作用.中国病理生理杂志，1995，11：251-255.

　　2，臧梦维，董伟华，孔天翰，等.马氏钳蝎毒分离组分Ⅲ体外抗癌活性的实验研究.中国病理生理杂志，1996，12：72-77.

　　3，董伟华，孔天翰，王成裕，等.蝎毒抗癌多肽对移植性肿瘤的抑制作用.河南医科大学学报，1999，34：61-63.

　　4，韩锐主编.抗癌药物研究与实验技术.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1997.295-298.

　　5，陈幸华，罗成基，郭朝华，等.放烧复合伤对小鼠骨髓基质祖细胞体外集落生成能力的影响.中华放射医学与防护杂志，1999，19：22-23.

　　6，邹仲敏，孙慧勤，罗成基.6 Gyγ射线照射诱导骨髓造血细胞凋亡.中华放射医学与防护杂志，1998，18：390-392.

　　7，刘淑华，周继文，雷伦君，等.⁶⁰Coγ射线一次和分次照射的生物效应.中华放射医学与防护杂志，1991，11：96-99.

　　8，Akita S,Nagayama M,Kaneda T,et al.Effect of γ-ray irradiation on superoxide dismutase activity and lipid level in mouse salivary gland.App Biothem,1984,6:64-69.

　　9，Ueda T,Toyoshima Y,Kushihashi T,et al.Effect of dimethy sulfoxide pretreatment on activities of lipid peroxide formation,superoxide dismutase and glutathione peroxidase in the mouse liver after whole-body irradiation.J Toxicol Sci,1993,18:239-244.

　　10，周红宁，王琪，阮建磊，等.电离辐射对小鼠移植性肝癌作用的实验研究.中华放射医学与防护杂志，1998，18：101-103.

(收稿日期:1999-11-28)