哮喘豚鼠肺组织PKC的表达及对TXA₂释放的影响

　　第三军医大学学报1999年第21卷第12期

　　吴奎　杨肇亨

　　提　要　目的：探讨蛋白激酶C(PKC)在哮喘发病中的作用。方法：采用卵蛋白雾化吸入致敏哮喘模型，在诱发哮喘24 h后，放射性同位素标记方法测定哮喘豚鼠肺组织总PKC活性及膜活性变化，采用免疫组织化学的方法检测肺组织PKC的表达，体外检测PKC活化剂PMA和抑制剂H-7对肺组织血栓烷A₂(TXA₂)释放的影响。结果：①哮喘组肺组织PKC活性显著增加；PKC呈强阳性表达；②PMA引起了肺组织TXA₂的释放的增加，而H-7则抑制了PMA的效应；③相关分析表明，PKC活性与TXA₂的释放量呈显著正相关。结论：PKC的过度表达可能在哮喘发病中起着重要作用，抑制PKC的活性可能是将来哮喘防治的另一条途径。

　　关键词：蛋白激酶C　血栓烷A₂　哮喘

　　蛋白激酶C(Protein kinase C,PKC)是一个在组织中广泛分布的磷酸化酶，静息状态下定位于细胞胞浆中，受到刺激后，它可以转位至胞膜而活化，在细胞分泌、增生、分化等功能中发挥着重要作用^［1］。支气管哮喘是有多种炎性细胞参与的气道慢性炎症^［2］，炎性细胞释放多种炎性介质引起气道上皮损伤，神经末梢暴露，支气管平滑肌增生肥厚，对刺激的反应性增加，诱发气道高反应性。在以上过程中，PKC起着重要信号转导作用。哮喘时肺组织中多种炎性细胞PKC的表达及活化增加，但肺组织中PKC的活化及其作用的研究较少。本实验采用卵蛋白(OVA)雾化吸入致敏和诱发豚鼠哮喘模型，哮喘发作24 h后以放射性同位素标记方法测定哮喘豚鼠肺组织PKC活性的变化，测定PKC活化剂PMA、抑制剂H-7对豚鼠肺组织炎性介质血栓烷A₂(TXA₂)释放的影响，并采用免疫组织化学方法，测定肺组织PKC表达及分布，以探讨PKC可能在哮喘发病过程中所起的作用，为寻求哮喘治疗的新途径提供一些可能有效的提示。

　　1　材料与方法

　　1.1　主要试剂

　　PMA、H-7、组蛋白H-_Ⅲss、PS Sigma公司；γ-³²P-ATP(比活度＞5　000 Ci/mmol)福瑞公司；APC试剂盒中山公司；抗PKC抗体Pharmigen公司；TXB₂放免药盒苏州医学院。

　　1.2　实验动物模型的制作及处理

　　1.2.1　哮喘动物模型的制作

　　20只雄性豚鼠，体重250～300 g，随机分为对照组(C)、哮喘组(A)。A组：参照Huston^［3］方法，第1、4、7天将1%的OVA雾化吸入3 min致敏琢鼠，第21～27天用2%的OVA雾化吸入5 min诱发其哮喘发作，诱发后24 h采集标本。C组：用生理盐水替代OVA致敏，诱发同A组。

　　1.2.2　标本采集　　实验豚鼠麻醉后，开胸暴露心脏，经左心室→主动脉弓灌注生理盐水约200 ml(至从左心房流出的液体基本清亮为止)，同时分离出气管，结扎左肺从根部剪下，置于4%多聚甲醛-PBS缓冲液固定，修整、石蜡包埋后，切5 μm切片。右肺在4℃条件下剪切成1 mm×1 mm大小的碎块，以备PKC提取及TXA₂的测定。

　　1.3　PKC活性的测定^［4］

　　1.3.1　组织样品的制备　　胞液和膜性酶液的制备：将剪碎的肺组织，称取0.25 g，进行列操作：(1)以1∶5(W∶V)的缓冲液(内含20 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl、0.25 mol/L蔗糖、0.5 mmol/L PMSF、2mmol/L EDTA、10 mmol/L EGTA)在冰浴中高速匀浆；(2)700×g离心去核(4℃、15 min)，超声粉碎；(3)上清液经(100000×g)4℃离心1h，上清液即为胞液PKC酶液；(4)①沉淀部分溶解于含有0.5%TritonX-100的上述缓冲液中；②冰浴中搅拌抽提1h；③100000×g、4℃离心1h，上清液为PKC膜性组分。

　　1.3.2　PKC活性的测定　　采用标记的放射性同位素法进行，总反应体积50 μl，内含终浓度25 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)、10 mmol/L MgCl₂、0.5 mol/L CaCl₂、10 μg PS、10 μg组蛋白H-_Ⅲss、10 μl酶制剂、1 μg PMA、加入γ-³²P-ATP 0.2 μCi起动反应；对照组用2.5 mmol/L EGTA代替PS、PMA和CaCl₂。37℃水浴中准确温育5 min，立即移入2℃～4℃冰浴中，随后加入10 μl 2 mmol/L EDTA终止反应、将液体移于微孔滤膜上，10%三氯乙酸抽滤2 ml×5，烤干后放入装有5 ml闪烁液(ppo 5 g、popop 0.2 g/1　000 ml甲苯)的液闪瓶内，于液闪仪测cpm，酶的活力单位以37℃时每分钟每毫克酶蛋白转移1 μmol磷酸根来表示，其表示单位为fmol/mg·min^-1。

　　1.3.3　蛋白定量　　采用Folin-酚法进行。

　　1.4　TXA₂的放免测定

　　1.4.1　样品制备

　　将剪碎的肺组织每只动物称取0.25 g×3，分别放入装有2ml台氏液(NaCl 8.0 g/L，KCl 0.2 g/L,CaCl₂ 0.2 g/L,NaHCO₃ 1.0 g/L,MgCl₂ 0.1 g/L,NaH₂PO₄ 0.05 g/L,Glucose 1.0 g/L)的A、B、C 3只试管中，其中A管中含有100 ng/ml H-7，先37℃孵育5 min，然后A、B 2管加PMA至10 ng/ml，3管同时37℃孵育30 min，吸取上清进行放射免疫测定(由于TXA₂代谢迅速，半衰期短，因此测定其稳定的代谢产物TXB₂以代替)。

　　1.4.2　放免测定根据试剂盒说明书进行。

　　1.5　PKC免疫组织化学染色

　　参照文献［5］进行。

　　观察方法及判断标准：阳性染色显示肺组织细胞及浸润的炎性细胞中出现黄色染色。每张切片由2位观察者独立计数，随机取染色区域4个高倍视野(×400)的阳性细胞平均数，用半定量计分，染色强度用0～3级计分：0：无染色；1：轻度阳性染色；2：中度阳性染色；3：强阳性染色；染色范围根据细胞阳性染色的百分数而分为0～4级；0：无染色；1：＜25%细胞染色；2：25～50%细胞染色；3：50～75%细胞染色;4：＞75%细胞染色。染色总评分为染色强度+染色范围。

　　1.6　数据统计学分析

　　本实验数据采用均数±标准差表示(X±s)。组间比较及相关分析全部用非配对计量资料检验和直线相关分析。P＜0.05表示相差或相关显著，P＜0.01表示相差或相关非常显著。

　　2　结果

　　2.1　实验动物肺组织中PKC活性的变化

　　结果表明，哮喘组动物总PKC活性明显高于对照组，且膜PKC活性及所占比例亦较对照组明显上升，见表1。

表1　各组肺组织总PKC及膜PKC活性(fmol/mg·min^-1，n=10)

　　PKC in lungtissue (fmol/mg·min^-1，n=10)

#:P＜0.05，*：P＜0.01 vs control

　　2.2　实验动物肺组织PKC的表达水平

　　实验动物肺组织PKC免疫组化结果镜下显示，哮喘组肺组织见较广泛阳性染色细胞，主要分布于支气管粘膜上皮、粘膜下、气管平滑肌，见图1，肺泡间、甚至肺泡腔内，见图2。高倍镜下见阳性染色PKC定位于胞浆及胞膜，呈棕黄色。正常组实验动物肺组织可见少许染色较浅细胞，见图3，气道粘膜光滑，染色较浅，见图4。肺组织PKC表达的半定量计分结果，见表2。

表2　肺组织PKC的表达(n=10)

　　tab 2　The expression of PKC in lung tissue (n=10)

*:P＜0.01 vs control

图1　哮喘豚鼠支气管腔嗜酸性细胞浸润，浸润细胞及支气管粘膜、气道平滑肌PKC呈强阳性表达(DAB显色，苏木素复染，×400)

　　fig 1　Infiltration of Eos in bronchial cavity,expression of PKC is strongly positive in infiltrated cells,bronchial mucosa and airway smooth muscle in bronchus of asthmatic guinea pig　(DAB stain,Hematoxylin restain,×400)

图2　哮喘豚鼠肺泡内大量炎性细胞浸润，PKC呈阳性表达(DAB显色，苏木素复染，×400)

　　fig 2　Massive infiltration of inflammatory cells in alveolar,positive expression of PKC in alveolus of asthmatic guinea pig　(DAB stain,Hematoxylin restain,×400)

图3　正常豚鼠肺泡内无炎性细胞浸润，PKC表达呈弱阳性(DAB显色，苏木素复染,×400)

　　fig 3　No inflammatory cells infiltration,PKC expression weak positive in alveolar of normal guinea pig　(DAB stain,Hematoxylin restain,×400)

图4　正常豚鼠支气管粘膜光滑，无炎性细胞浸润，PKC表达呈弱阳性

　　(DAB显色，苏木素复染，×400)

　　Fig 4　Mucosa of bronchus smooth,no inflammatory cell infiltration,PKC expression weak positive in normal guinea pig　(DAB stain,Hematoxylin restain,×400)

　　2.3　PKC对肺组织释放TXA₂的作用　　放免结果显示，PKC活化剂PMA可以刺激肺组织释放TXA₂，而其抑制剂H-7则显著抑制PMA的作用，见表3。

表3　PKC活化剂和抑制剂对TXA₂释放的作用(pg/ml,n=10)

　　inhibitor of PKC(pg/ml，n=10)

　　*：P＜0.01 vs control；#：P＜0.01 vs H-7+PMA；**：P＞0.05 vs without medicine

　　2.4　相关分析

　　相关分析表明，PKC活性PMA诱导的TXA₂释放量呈显著正相关(γ=0.702;P＜0.01)。

　　3　讨论

　　本研究采用了同位素标记γ-³²P-ATP测定哮喘豚鼠肺组织中PKC活性的变化及其在细胞中定位比例的变化；采用免疫组织化学的方法，检测PKC在肺组织中的表达和分布；并且分别采用PKC活化剂PMA以及抑制剂H-7加PMA处理肺组织，检测对炎症介质TXA₂释放的影响。结果表明，哮喘豚鼠肺组织中总PKC活性较正常组显著增高，膜PKC活性所占比例与正常组相比亦显著增高，提示哮喘时PKC活性增加及活化。免疫组化结果表明，正常豚鼠肺组织中见PKC呈弱阳性表达，而哮喘组豚鼠肺组织中支气管粘膜、肺泡、毛细血管、以及肺泡内浸润的炎性细胞中均见PKC呈强阳性表达。PMA导致肺组织释放TXA₂增加，而先用H-7预处理后再加PMA则未引起TXA₂的释放。

　　研究表明，在哮喘发病过程中，炎性细胞出现了PKC活性变化，以及PKC分布比例的变化。Bansal^［6］研究发现，哮喘患者淋巴细胞总PKC活性增加，膜PKC活性所占比例亦显著增加，且患者的一秒钟用力呼气量(FEV1)与总PKC活性显著负相关。Bates等^［7］的研究表明，哮喘病人的血和BALF低密度嗜酸性粒细胞PKC活性显著增加。本实验结果和Bansal^［6］、Bates等^［7］的结果相符，表明哮喘动物不仅出现PKC含量增加，同时发生PKC的转位活化。

　　已知PMA是PKC的高效活化剂，而H-7是PKC的特异性抑制剂，说明是PKC的活化引起了TXA₂的释放增加，而PKC的抑制剂则阻抑了TXA₂的合成及释放。相关分析表明PKC活性与TXA₂的释放量呈显著正相关。PKC活化引起TXA₂释放增加的作用的可能机制是促使TXA₂的合成增加。因为TXA₂的半衰期极短，生成后迅速代谢成为TXB₂而灭活。据报道，PKC的活化还可引起cPLA₂^［8］、COX^［9］活性增加。cPLA₂活性增加引起花生四烯酸(AA)的生成增加，COX活性增加则促使AA向TXA₂转变。既往研究证实，PKC活化可以引起肥大细胞、T淋巴细胞、Eos、中性粒细胞、巨噬细胞、嗜碱性粒细胞等释放组织胺、白三烯、TXA₂，诱发IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-16、INF-α等的表达、分泌增加，诱发炎性细胞脱颗粒、粘附、呼吸暴发。

　　本实验表明，在哮喘豚鼠肺组织中，组织细胞中PKC表达增加，伴PKC的转位活化。PKC的活化进一步引起炎性介质释放增加，而PKC特异性抑制剂H-7阻抑炎性介质的释放，说明PKC在哮喘炎性介质的释放中起着重要作用。

　　作者简介：吴　奎，男，1971.01.02生，江苏省沛县人，硕士，住院医师，主要从事哮喘发病机制方面的研究，发表论文2篇。电话：(023)68757625

　　作者单位：第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所呼吸内科，重庆 400042

　　参考文献

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