模拟高原低压舱治疗哮喘缓解期豚鼠对血清皮质醇及嗜酸性粒细胞的影响
第三军医大学学报1999年第21卷第5期
熊建平 孔祥英
提 要 目的：探讨模拟高原缺氧条件治疗哮喘的机制，为临床应用模拟高原低压舱治疗儿童哮喘提供部分理论依据。方法：采用10%卵蛋白(OA)致敏和5次1%OA诱发复制哮喘豚鼠动物模型，设立正常对照组、哮喘对照组和低压舱治疗组3组。利用模拟4000m海拔高原条件的低压舱治疗干预，结束后3组均作外周血和BALF中EOS计数以及血清皮质醇检测，并进行统计学分析。结果：哮喘对照组和低压舱治疗组外周血EOS、BALF中EOS绝对值均非常显著高于正常对照组，低压舱组非常显著低于哮喘对照组(P＜0.01)；哮喘对照组和低压舱治疗组的BALF中HEOS百分率均非常显著高于正常对照组，低压舱治疗组非常显著低于哮喘对照组(P＜0.01)；正常对照组和低压舱治疗组的血清皮质醇含量均非常显著地高于哮喘对照组，但低压舱治疗组与正常对照组差异不显著(P＞0.05)。结论：模拟高原低压舱治疗能使哮喘缓解期豚鼠血清皮质醇升高，进而使其外周血EOS和BALF中EOS减少，有利于预防哮喘复发或减轻哮喘发作症状，可作为临床预防和治疗哮喘的一种新方法。
关键词：低压舱 豚鼠 哮喘 皮质醇 嗜酸性粒细胞
哮喘是儿童较为常见的一种阻塞性肺疾病，严重影响身心健康。目前临床上仍以皮质激素作为控制哮喘症状的首选药物，而国内外早有报道应用高原气候条件治疗哮喘，取得良好疗效。本实验利用模拟高原环境的低压舱干预哮喘缓解期豚鼠，通过测定血清皮质醇、外周血和支气管肺泡灌洗液中EOS计数等，来探讨低压舱治疗哮喘的机制，现报告如下。
1 材料和方法
1.1 动物分组和哮喘动物模型的复制
1.1.1动物分组和饲养 采用第三军医大学实验动物中心提供的30只豚鼠，雌雄不拘，体重350～450g，随机分为正常对照组、哮喘对照组和低压舱治疗组3组，雌雄分笼，予小颗粒饲料和青菜叶混合饲养，并注意每天饮水和保持巢穴清洁、通风、干燥。
1.1.2 动物模型的复制 哮喘对照组和低压舱治疗组豚鼠采用传统方法加以改进［1］，并结合王长征［2］的方法复制哮喘动物模型，即第1天用10%卵蛋白(OA)1ml腹腔注射致敏，第15天用1%OA超声雾化吸入30min诱发哮喘(以豚鼠出现烦躁、打喷嚏、咳嗽、腹肌强烈收缩、呼吸急促等典型哮喘样发作为标准)，以后隔天1次，共5次。第1次诱发前45～60min给予苯海拉明10mg/kg耳后皮下注射预防豚鼠哮喘发作时突然死亡。正常对照组豚鼠用生理盐水代替OA处理。
1.2 低压舱治疗
低压舱治疗组豚鼠在5次哮喘诱发成功后，次日在模拟海拔4000m高原条件的动物低压舱治疗10d，2h/d。
1.3 检测方法
1.3.1外周血嗜酸性粒细胞(EOS)计数 治疗结束后，3组豚鼠均从后足掌采取外周血20μl悬于0.38ml嗜酸性粒细胞计数液中，用计数板在显微镜下直接作嗜酸性粒细胞计数。
1.3.2 支气管肺泡灌洗液(BALF)中嗜酸性粒细胞(EOS)计数 ①支气管肺泡灌洗液的收集：所有豚鼠经股动脉放血后，立即分离气管，并做气管切开插管固定，经导管缓慢注入4℃无菌Hanks液10ml×3次，保留片刻后反复灌洗，并轻轻回抽，回收率＞50%者方可进行EOS分离。将所得支气管肺泡灌洗液按1000r/min的速度离心10min，弃掉上清液，沉淀细胞用Hanks液再冲洗、离心3次，最后收集细胞重悬于比重为1.070的1ml percoll液中。②BALF中EOS的分离和低密度EOS(HEOS)计数：按文献［3］方法配制好不同比重的Percoll液，在5ml的离心管中依次缓慢加入比重为1.100、1.090、1.085、1.080的Percoll液各1ml(注意不能混匀)，然后沿管壁轻轻加入上述细胞悬液，用4℃离心机按2500～3000r/min速度离心20min。将比重≤1.085的EOS定为HEOS。收集比重高于和低于或等于1.085的两管液体，分别充分混匀，取20μl悬于0.38ml嗜酸性粒细胞稀释液中，用计数板在显微镜下直接作嗜酸性粒细胞计数，计算出BALF中EOS的绝对数和HEOS的百分比。
1.3.3 血清皮质醇的测定 豚鼠麻醉后，经股动脉放血，收集3ml置于干燥管中，分离得血清0.5ml。首先在塑料管上编号，包括非特异管(Non specific binding sample,NSB)、零结合管(Binding sample 0,B0)、标准管(Standard sample,S1～S6)和待测标本样品管(Unknown sample,U)，按表1方法加样(μl)摇匀后，37℃温育1h，4℃30min后进行测定。
表1 血清皮质醇水平的测定方法
tab 1 The procedure of determination of serum cortisol
| Type of tubes |
No.of tubes |
Diluent |
Standard |
Sample |
125I-Cortisol |
Antibody |
ISR |
| NSB |
1～2 |
150 |
- |
- |
100 |
- |
1000 |
| B0 |
3～4 |
50 |
- |
- |
100 |
100 |
1000 |
| S1～S6 |
5～16 |
- |
50 |
- |
100 |
100 |
1000 |
| U |
17～ |
- |
- |
50 |
100 |
100 |
1000 |
ISR：Immunological separating reagent
摇匀，4℃放置15min，任取3管测总放射性计算均值(T)，3500r/min离心20min，弃掉上清液，采用放射免疫分析仪测定标本放射性计数，并经计算机处理，将结果打印出来。
1.4 统计学方法
采用第三军医大学数学教研室提供的医用统计程序包SPMR中单因素方差分析(PDA-2)，实验数据用X±s表示，应用计算机作统计学处理。
2 结果
外周血EOS计数(单位：×106/L)、BALF中EOS绝对值计数(单位：×106)和HEOS百分比以及血清皮质醇含量(单位：μg/L)比较见表2。
表2 外周血、BALF中EOS计数和HEOS百分比及血清皮质醇水平
tab 2 EOS count of PB and BALF, percentage of HEOS and content of serum cortisol
| |
NCG |
AG |
HCTG |
| EOS count of PB |
28.60±10.63 |
288.20±59.98 |
138.60±27.54*# |
| EOS count of BALF |
2.08±0.41 |
6.42±2.01* |
3.11±0.31*# |
| Percentage of HEOS |
0.28±0.11 |
0.68±0.07* |
0.58±0.07*# |
| Content of serum cortisol |
390.57±86.39 |
118.81±58.81* |
383.01±98.01# |
AG：Asthmatic group;HCTG:Hypobaric chamber-treated group;NCG:Normal control group;:P＜0.01 vs NCG;#:P＜0.01 vs AG
3 讨论
哮喘是一种以气道高反应性为主要特征的阻塞性肺疾病。这种气道高反应性与慢性变态反应性气道炎症有关，且嗜酸性粒细胞(EOS)是重要的效应细胞。现有资料显示，哮喘机体内源性皮质醇水平偏低或其受体功能缺陷而造成体内糖皮质激素相对不足是哮喘发作和恶化的一个原因，也是临床上首选激素类药物来控制哮喘发作的依据。然而长期使用激素治疗哮喘也有其弊端，国外早有人利用高原环境治疗哮喘，取得较好疗效，并证实高原气候条件能提高患者内源性皮质醇水平，降低其外周血及BALF中EOS数，并降低气道的高反应性［4］，与国内缪琪蕾［5］报道的结果基本一致。而且，中科院上海生理研究所和上海第六人民医院合作利用模拟高原条件的低压舱治疗来预防哮喘复发取得较好疗效，但治疗机制未阐述。
本实验通过OA致敏和诱发哮喘，成功地复制了豚鼠哮喘模型，其外周血EOS及BALF中EOS显著增多。利用模拟高原条件的低压舱治疗哮喘缓解期豚鼠10d，能较为有效地提高血清皮质醇水平，并降低外周血和BALF中的嗜酸性粒细胞数量，同时亦使HEOS不同程度下降，取得与国内外高原环境治疗哮喘基本相同的结果。推测其机理可能是通过低氧这一良性应激原，刺激机体下丘脑-垂体-肾上腺轴等兴奋而产生应激反应，从而提高机体内源性血清皮质醇水平，进而通过：①抑制T淋巴细胞尤其是CD4+的T淋巴细胞活性，进而降低全身和局部的IL-5、GM-CSF等水平；②促进淋巴细胞高表达Fas抗原，通过Fas/Fas l诱导EOS等炎症细胞的凋亡［6，7］，共同抑制EOS活化、缩短其生存时间，促进EOS凋亡。因此，活化的EOS(HEOS或EG2+)减少，可使其合成和释放白三烯(LTs)、血小板活化因子(PAF)、主要碱性蛋白(MBP)、嗜酸性阳离子蛋白(ECP)、神经毒蛋白(ENP)、过氧化酶(EPO)和氧自由基等毒性颗粒相应减少［8］，同时，其表达IL-5和VLA-4等亦减少［9，10］，进一步减轻了EOS在炎症局部的粘附、聚集、趋化和活化。此外糖皮质激素可与细胞内其受体结合，诱导一种分子量约(40～45)×103u的蛋白质-巨皮质素(又称调脂蛋白)合成，抑制磷脂酶A2活性而减少花生四烯酸的合成和释放，从而减少了前列腺素(PGs)、白三烯(LTs)及血栓素(Tx)等炎性介质的生成、释放和激活，能较为有效地抑制变态反应的强度［11］。三者共同减轻哮喘患者气道变态反应性炎症，进而降低气道高反应性，最终使哮喘病人减轻症状、减少复发。
(感谢第三军医大学高原医学教研室提供动物低压舱!)
作者简介：熊建平，男，28岁，住院医师，硕士研究生
作者单位：第三军医大学附属西南医院小儿科 重庆，400038
参考文献
1 刘朝晖，徐军，钟南山.内皮素、肿瘤坏死因子在哮喘发病中的作用.中华结核和呼吸杂志，1995，18(6)：366
2 王长征，郭先健，王顺朝.雷公藤甲素对哮喘动物模型气道反应性的观察.中华医学杂志，1996，76(1)：68
3 Day r P.Eosinophil cell separation from human peripheral blood.Immunology,1970,18(2):955
4 De bie T J, Hessel E M, Van Ark, et al. Effect of dexamethasone and endogenous corticosterone on airway hyperresponsiveness and eosinophilia in the mouse. Br J pharmacology,1996,119(7):1484
5 缪琪蕾.高原气候降低居室尘埃螨过敏性哮喘小儿的周围血T淋巴细胞活性、嗜曙红细胞增多和支气管阻塞.高原医学杂志，1995，5(3)：35
6 Adachi t, Motojima S, Hirata A, et al. Eosinophil apoptosis caused by theophylline, glucocorticoids, and macrolides after stimulation with IL-5. J Allergy Clin immunol,1996,98(6 pt2):S207
7 Matsumoto k, Schleimer R P, Saito H, et al. Induction of apoptosis in human eosinophils by anti Fas antibody treatment in vitro. Blood, 1995,86(2):1437
8 Ackerman s J. Distinctive cationic protein of the human eosinophil granule: major basic protein, eosinophil cationic protein and eosinophil-derived neurotoxin. J immunol, 1983,131(6):2977
9 Walsh g M, Hartnell A. IL-5 enhances the in vitro adhesion of human eosinophils, but not neutrophils, in a leukocyte integrin-dependent manner. immunology,1990,71(2):258
10 Laudanna c, Bonizzato C, Piacentini G, et al. Crosslinking of members of the 1 and 2 subfamily of integrins triggers eosinophil respiratory burst and spreading. immunology,1993,80(2):273
11 冯新为主编.病理生理学.第3版.北京：人民卫生出版社，1993.173～174
用户登录 
新用户注册