⁶⁰Co照射诱导急性髓系白血病细胞bcl-2基因家族表达变化分析

中华放射医学与防护杂志 1998年第5期第18卷 基础研究

作者：周剑锋　刘文励　李崇渔　邹萍　杨林花　乔振华　周木想　Findley HW　王辨明

单位：周剑峰　刘文励　(武汉，同济医科大学附属同济医院血液科　430030)；李崇渔　邹萍　王辨明　(同济医科大学附属协和医院血研所)；杨林花　乔振华　(山西医科大学附属二院血液科)；周木想　Findley HW　(Emory University School of Medicine)

　　Bcl-2是最重要的抗凋亡基因之一，既往对bcl-2家族基因表达特点与肿瘤临床特征、疗效关系的认识，主要源于肿瘤细胞系，而以原代肿瘤细胞为研究对象，结合临床资料分析bcl-2基因家族在肿瘤形成、治疗反应性中的意义探讨少见。为此，我们用⁶⁰Co照射处理原代急性髓系白血病细胞，观察了bcl-2基因家族功能状况对凋亡敏感性的影响。

　　 1　材料和方法

　　1.1　病例：8例不同预后AML为我院经细胞形态学，免疫学分型确诊病例。全部病例均于化疗前采集骨髓，分离AML细胞，并于3个疗程标准诱导方案化疗后进行疗效判定。采用1987年苏州“全国白血病化疗讨论会”疗效标准，将病例分为未缓解(NR，4例)，缓解(CR，4例)，急性早幼粒细胞白血病细胞系HL-60细胞系引自美国典型生物物种保藏中心(ATCC)。HL-60细胞系为p53基因缺失株。8例AML均为野生型p53(Wt-p53)表型。

　　 1.2　主要试剂：尼龙膜，Trizol总RNA提取试剂盒，缺口平移探针标记盒，Sephadex G-75购自Gibco公司。α-³²P-dCTP购自北京亚辉公司。SFFV.neo-bcl-X_L质粒由Michigan大学Dr.Castle惠赠，BK-KSA-bcl-2,7027 cDNA-Bax质粒由Washington大学Dr.Korsemeyer惠赠。

　　 1.3　标本处理及检测

　　 1.3.1　⁶⁰Co细胞照射：新鲜分离细胞调浓度为1×10⁶/ml，悬浮培养于10%FCS RPMI 1640液中，用⁶⁰Co放疗机行照射。吸收剂量率0.68Gy/min,吸收剂量为7Gy，此剂量系参考Lowe等^［5］所用剂量.为亚致死剂量，对骨髓细胞而言，属致损伤量，代表常规治疗剂量。照射后于37℃、饱和湿度5%CO₂条件下孵育8小时，离心收集细胞，取1×10⁶细胞行吖啶橙(Ao)染色，2×10⁶细胞用70%乙醇固定后用于流式细胞术(FCM)分析凋亡率。照射前后细胞提取总RNA，用于Northern blot分析。

　　 1.3.2　FCM：经预处理的AML细胞从-20℃取出，离心弃上清，加80μl柠檬酸液，室温30分钟后1000g离心5分钟，取上清于EP管。细胞沉淀用PBS重新洗3次，用RNA酶，PI染液等FCM常规预处理后上机测试，用Multicycle DNA分析软件分析DNA含量。凋亡细胞DNA含量低于G₀/G₁二倍体含量而出现G₀/G₁峰(AP)，即凋亡率。

　　 1.3.3　Ao染色：细胞受照后，离心涂片,干片后用甲醇固定5分钟，加1滴PBS润湿细胞，用Ao/PBS (1∶10000)染5分钟，PBS洗片，在荧光显微镜下观察拍照。

　　 1.3.4　Northern blot:异硫氰酸胍一步法提取总RNA后，20μg总RNA 于1%甲醛变性胶电泳分离后，经快速倒转法将RNA转至尼龙膜。酶切回收bcl-2(1.9kb)、bax(1 kb)、bcl-X_L(800 bp)探针，经缺口平移法标记α-³²P-dCTP,Sephadex G-75纯化标记探针。因bcl-2、bcl-X_L、bax mRNA长度分别为6.3，2.7，1.5～1.0kb,放3种探针各0.5μg进入同一杂交体系，进行杂交。将尼龙膜在50%去离子甲酰胺，5×SSC，1%SDS，5×Denhart's,20%葡聚糖，100μg/ml SSDNA在42℃恒温水浴摇床预杂交4 小时后，加入探针继续杂交20小时，用2×SSC，0.5% SDS/1×SSC溶液依次洗膜，终洗膜条件为1×SSC/1%SDS，60℃洗15～20分钟，Monitor监测洗膜效应。略干后压片，将带高效增感屏的曝光盒放-70℃冰箱曝光1周后冲片。将尼龙膜于1 mmol/L Tris·cl,1 mmol/L EDTA (pH8.0)，0.1×Denhard's液中75℃ 2小时去探针，与β-actin探针重新杂交步骤同上。

　　 1.3.5　Northern blot图像及数据处理：放射自显影图像经薄层层析扫描仪CS-910分析mRNA的表达丰度，bcl-2、bax mRNA的丰度用HL-60丰度的相对倍数表示，bcl-X_L的丰度以1例AML bcl-X_L丰度的相对倍数表示。所有数据均为t检验统计分析。

　　 2　结果

　　2.1　HL-60细胞系有bcl-2 mRNA和低水平的bax mRNA表达。⁶⁰Co照射后分别出现表达受抑和增强现象，bcl-X_L mRNA表达缺失，与文献报告相符。CR和NR组在⁶⁰Co照射前后的表达丰度见附表，照射前NR组bcl-2、bcl-X_L表达高于CR组，bax表达无差异，照射后CR、NR两组均出现不同程度的bcl-2，bcl-X_L表达受抑，bax表达增强现象。其中NR组的bcl-2、bcl-X_L受抑后表达仍高于CR组。而NR组的bax增强后表达仍明显低于CR组。

附表　⁶⁰Co照射后bcl-2、bax、bcl-X_L　mRNA表达与凋亡率的关系

　　注：CR比NR组　* P＜0.05；** P＜0.01

　　2.2　⁶⁰Co照射诱导的细胞凋亡敏感性分析：⁶⁰Co照射后，AML细胞出现典型的凋亡形态，FCM分析显示，临床耐药的NR组的凋亡敏感性远低于CR组，bcl-2、bcl-X_L mRNA的照前、照后表达丰度，bax mRNA的照后表达丰度与凋亡敏感性相关，高bcl-2、bcl-X_L表达，低bax诱导表达水平的NR组对⁶⁰Co照射诱导的凋亡耐受。FCM分析结果显示了NR，CR组凋亡敏感性的差异。

　　3　讨论

　　放射线、化疗药物等均能通过DNA损伤的基因毒性(genotoxicity)致肿瘤细胞坏死及诱导细胞凋亡。细胞凋亡是机体在基因介导下主动清除损伤细胞的方式。现认为诱导细胞凋亡是放、化疗的关键疗效机制之一。因此理解DNA损伤诱导凋亡的基因径路的调控方式，对提高放化疗疗效具有指导意义。本研究用7 Gy亚致死剂量⁶⁰Co照射原代AML细胞，观察到亚致死DNA损伤可抑制抗凋亡基因bcl-2、bcl-X_L转录水平的表达，并增强凋亡基因bax的转录，通过改变细胞内凋亡抗凋亡基因产物的比率诱导细胞凋亡。高基础表达的bcl-2、bcl-X_L细胞，经DNA损伤后，仍保留较高水平的转录水平，与bax转录诱导障碍协同，使之对凋亡的敏感性降低。从而成为临床放化疗疗效不佳的内在生物学基础。本组AML病例bcl-2基因家族的功能状况与临床化疗疗效密切相关，说明原代肿瘤细胞凋亡径路的异质性是影响疗效的重要因素，这对指导选择有效的治疗方案，设计整体的治疗策略甚为重要。

　　近来研究肿瘤细胞系发现，细胞内Wt-p53蛋白可识别DNA损伤，通过转录后机制使Wt-p53蛋白在细胞内积聚，Wt-p53蛋白作为转录因子，激活bax转录表达，抑制bcl-2的转录，从而构成DNA损伤诱导凋亡的径路^［3，4］。本实验在具有Wt-p53表型的原代AML细胞中观察到类似的调控模式，并发现DNA损害亦下调bcl-X_L的表达，对既往的发现是一种重要补充。此外在缺失p53的HL-60细胞系中，同样出现bcl-2下调，bax上调的变化，说明存在Wt-p53外的DNA损伤凋亡诱导径路，这与Lowe^［5］等的结论相符。

　　正常造血细胞仅微弱表达bcl-2、bcl-X_L　mRNA，而本组原代AML均存在bcl-2、bcl-X_L的高表达。既往研究^［1］证实初诊AML细胞的增殖活动低于正常骨髓细胞。这表明细胞凋亡的功能障碍，在AML恶性克隆的形成、扩展，进而形成病态造血的演变中，有不亚于细胞增殖失控的病理生理意义，深入研究其失衡的机制，对AML的防治十分重要。

　　本课题受国家教委留学回国人员课题基金资助

　　 参考文献

　　1　刘艳荣，陈珊珊，李鲲.用流式细胞仪测定成人白血病骨髓细胞原位DNA、RNA蛋白质量.中华血液学杂志，1991，12：128.

　　2　Fan S.El-Deiry WS.Bae I,et al.p53 gene mutations are associated with decreased sensitivity in human lymphoma cells to DNA damaging agents.Cancer Res,1994,54:5824.

　　3 Lee S,Elenbaas B,Levine A,et al.p53 and its 14KPa c-lermicnal domain recognized primary DNA damage in the form of insertion/deletion mismatches.Cell,1995,81:1013.

　　4 Miyashita T and Reed JC.Tumor suppressor p53 is a direct transcriptional activator of the human bax gene.Cell,1995,80:293.

　　5 Lowe SW,Ruley HE,Jacks T,et al.p53-dependent apoptosis modulated the cytotoxicity of anticancer agents.Cell,1993,74:957.

(收稿：1997-02-03　　修回：1997-04-29)