胚胎肝发育相关基因-1在氯高铁血红素诱导分化的红白血病细胞中的表达
安徽医科大学学报 2000年第5期第35卷 基础医学研究
作者：王丹 汪思应 胡兆平 许望翔 杨晓明
单位：王丹（安徽省立医院输血科，合肥 230001）；汪思应（安徽医科大学病理生理学教研室，合肥 230032）；胡兆平（安徽省立医院输血科，合肥 230001）；许望翔 杨晓明（北京军事医学科学院二所十室，北京 100051）
关键词：血液肿瘤；氯化血红素
摘要：目的 研究胚胎肝发育相关基因-1（EDAG-1）在红系肿瘤分化中的表达及意义。方法 用细胞生物学、RT-PCR及Northern杂交法。结果 含4.0×10-5 mol*L-1氯高铁血红素(Hemin)的RPMI 1640培养K562细胞5天，可使70%～80%细胞呈现正常红系特征； EDAG-1 、c-fos表达降低。结论 Hemin可诱导红白血病细胞分化； EDAG-1、 c-fos表达下调可能与其有关。
自由词：胚胎肝发育相关基因-1
中图书类号：R733.7 文献标识码：A
文章编号：1000-1492(2000)05-0336-03
肿瘤的诱导分化是目前临床及基础研究的热门课题，已发现大多数肿瘤尤其是血液系统肿瘤可被诱导向正常细胞转化，但分化的机制却不明了。胚胎肝发育相关基因-1(EDAG-1)是我们在用RDA技术建立的4月龄人胎肝组织与成年肝组织的差异表达基因EST文库中发现的一株未注册序列，Northern 杂交表明其mRNA约2.2 kb,经筛选人胎肝cDNA文库获1.9 kb的片段，进而利用5′RACE技术获得该基因全长序列，序列分析表明该基因编码的是由309个氨基酸组成的蛋白质，经检索与GeneBank注册序列无同源序列，已在GeneBank注册（注册号bankit316865AF228713），命名为EDAG-1。初步揭示该基因特异高表达在人胎肝组织及部分肿瘤细胞中，在成人心、肝、脾、肺、脑、胸腺、肌肉等组织均无表达(待发表资料)。鉴于4 月龄人胎肝组织富含细胞增殖、分化相关基因，我们推测该基因可能与血细胞增殖、分化有关。因此我们检测该基因在Hemin诱导分化的人红白血病细胞中的表达，观察是否与红系分化、增殖相关及在红白血病细胞诱导分化中的意义。
1 材料与方法
1.1 K562细胞培养、诱导分化及联苯胺染色鉴定 K562 细胞由军科院基础医学研究所三所王敦成博士惠赠。按常规将细胞悬浮于含10%胎牛血清的RPMI 1640中，37℃、5% CO2条件下培养。取呈指数生长期K562细胞按1×109个*L-1细胞浓度，加含4.0×10-5 mol*L-1 Hemin（Sigma）的上述培养液持续培养5天。取正常K562及氯高铁血红素(Hemin)诱导培养1～5天的细胞滴片，甲醛固定，滴加1%联苯胺染液3 min，滴加7.5%双氧水1 min，蒸馏水冲洗后加瑞氏液染色，水洗，干燥，光镜（10×100）计数染色阳性细胞。其中红系细胞经联苯胺染色后，胞浆呈现黄褐色，胞核为紫蓝色（计为阳性）。
1.2 3H-TdR掺入法检测K562细胞增殖能力 详见参考文献〔1〕。
1.3 细胞总RNA的提取 取诱导培养不同时间的K562细胞，用Promege公司RNA提取试剂盒提取细胞总RNA并紫外光定量。
1.4 EDAG-1 cDNA探针的制备 采用随机引物标记法。DNA模板25 ng，加入10 μl标记5×buffer, 3 mol*L-1 dGTP、dTTP 、dCTP混合液各2 μl, BSA 2 μl, DNA多聚酶5U及α-32P-dATP 5 μl,反应体积50 μl,室温1 h后终止反应并用Sephdex G-50柱纯化探针。
1.5 Northern 杂交 取K562细胞总RNA 30 μg进行1%甲醛变性凝胶电泳，转印硝酸纤维素膜，膜在80℃烘干2 h，加入6×SSC，5×Denhandts, 0.5% SDS, 1.0×10-4 mg*L-1鲑精DNA，在68℃预杂交1 h，加入变性后探针，68℃杂交过夜；以含0.5% SDS的2×SSC室温下洗膜2次，再用含0.5% SDS的0.5%×SSC 50℃洗膜2次,室温干燥后-70℃下放射自显影。
1.6 RT-PCR 以Oligo(DT)为起始引物，加入K562细胞总RNA 1 μg ,72℃ 10 min后, 依次加入无RNase水，10×RT buffer, 2.5×10-2 mol*L-1 MgCl2, 2.5×10-4 mol*L-1 dNTPs, RNasin和AMV逆转录酶，反应体系为20 μl, 42℃保温 15 min后,加去离子水至100 μl。并以此为模板进行PCR。 PCR引物如下：
c-fos sense 5′-GAGCTGACAGATACACTCCAAGCG-3′
antisense5′- CAGTCTGCTGCATAGAAGGAACCG-3′
G3PDH sense 5′-TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3′
antisense5′-CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC-3′
取逆转录产物5 μl为模板，依次加入10×buffer, 2.5×10-3 mol*L-1 dNTPs, 上下游引物，去离子水和Taq酶，反应体积为25 μl, 循环条件为94℃ 1 min, 60℃ 1 min, 72℃ 1 min，共18或30循环，在同一条件下，每次PCR以G3PDH作内对照，PCR产物经1.5%琼脂糖中电泳，凝胶成像仪扫描成像。
2 结果
2.1 Hemin 诱导K562细胞向红系分化及细胞增殖检测：联苯胺染色发现，经Hemin诱导培养5天，约70% K562细胞胞浆呈黄褐色，而正常培养的K562细胞仅有6%左右呈黄褐色胞浆（图1）；细胞增殖性检测发现经Hemin诱导后，K562细胞3H掺入明显降低（表1）。
图1 Hemin诱导对K562细胞分化的影响
A.RPMI 1640+Hemin培养5天的K562；
B.RPMI 1640培养的K562
2．2 EDAG-1在诱导分化的K562细胞中的表达 用α-32P标记EDAG-1cDNA 探针进行Northern Blotting, 结果显示，在Hemin诱导培养而向红系分化的K562细胞中，EDAG-1表达水平明显下调（图2）。
表1 Hemin诱导对K562细胞增殖的影响 (n=5)
| Hemin诱导 |
3H掺入CPM（ ±s） |
联苯胺染色阳性（%） |
| 0天 |
6 054.3±655.5 |
6 |
| 1天 |
5 774.8±391.9 |
14 |
| 2天 |
5 710.3±513.9 |
17 |
| 3天 |
4 356.3±638.3** |
19 |
| 4天 |
1 943.5±146.0** |
35 |
| 5天 |
1 870.5±831.6** |
73 |
t检验，与0天比较：**P＜0.01
图2 EDAG-1在Hemin诱导分化的K562细胞中的表达
上排：18 s RNA 下排:2.2 kb EDAG-1
2.3 c-fos在K562细胞中的表达 用正常及经Hemin诱导培养的K562细胞总RNA（各1 μg）反转录产物进行PCR, 结果显示，c-fos在K562细胞组，18或30循环PCR均出现明显阳性扩增，而在Hemin诱导分化K562细胞组，30循环PCR仅出现弱阳性扩增，18循环PCR无明显阳性扩增（图3）。
图3 c-fos在不同处理K562细胞中的表达
A.18循环；B.30循环；C.G3PDH 内对照；D.DL2000 Marker; E.Hemin诱导5天的K562细胞组；F.正常K562细胞组
3 讨论
K562细胞是人红白血病肿瘤细胞，具备恶性肿瘤细胞生物学特征。它也可被不同试剂诱导向正常细胞分化，如维甲酸及DMSO可诱导其向粒系分化； Hemin等可诱导其向红系分化〔2〕。在向红系分化过程中，细胞逐渐表现幼红细胞的某些特征如胞浆中出现血红蛋白等，同时细胞增殖能力下降。本研究用含4.0×10-5 mol*L-1 Hemin的RPMI 1640培养诱导K562细胞，使其向红系分化。实验发现随Hemin 诱导时间增加，3H掺入明显降低，说明K562细胞的增殖能力下降。同时联苯胺染色发现有约70%的胞浆呈黄褐色的细胞，表明有大部分K562细胞已分化成红系细胞，具有产生血红蛋白的能力。
我们已发现EDAG-1在胚胎及部分肿瘤组织中高丰度表达(待发表资料)。本实验Northern杂交也证实其在K562细胞中高表达，而在经Hemin诱导4～5天 K562细胞中表达明显下调，提示该基因可能与细胞增殖或分化尤其是红系的分化相关，但机制不清。RT-PCR发现c-fos在Hemin诱导5天的K562细胞中表达也明显下调,这类下调在其它肿瘤诱导分化过程中常常见到，被认为是肿瘤诱导分化的机制之一〔3〕。本实验结果中EDAG-1与c-fos表达降低的意义及相互关系有待进一步研究。
Expression of EDAG-1 genes in K562 cells induced by hemin
Wang Dan, Wang Siying, Hu Zhaoping et al
(Dept of Hematology, Anhui Provincial Hosptial,Hefei 230001)
Abstract：Objective To study the expression and role of EDAG-1 in erythroleukemia differentiation induced by Hemin. Methods Techniques of cellular biology were used to analyse K562 cells differentiation; Northern blotting and RT-PCR were used to study the expression of EDAG-1 and c-fos gene. Results 70%～80% K562 cells were induced to differentiate to erythrocytes by 4.0×10-5 mol*L-1 Hemin; There was slower proliferation in these cells; the expression of the EDAG-1 and c-fos decreased in differentiated K562 cells. Conclusion K562 cells can be induced to differentiate by Hemin. EDAG-1 and c-fos may be involved in the process.
MeSH：hemotologic neoplasms;hemin
Free words：EDAG-1
基金项目：国家自然科学基金资助课题（编号：39670366）
作者简介：王丹，女，35岁，检验师；杨晓明，男，38岁，博士，副研究员
参考文献
1，邓松华，汪思应，程 洁 等.己烯雌酚对肿瘤生长、转移的影响及机制探讨.临床与实验病理学杂志，1998;14（3）：279～281
2，程惠黎.肿瘤逆转.见：汤钊猷主编.现代肿瘤学, 上海:上海医科大学出版社，1993：157～167
2000-08-11收稿
2000-08-29修回
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