急性非淋巴细胞白血病p16基因缺失的意义
安徽医科大学学报 2000年第1期第35卷 经验与体会
作者：夏瑞祥 汪惠园 汪渊 周青 刘虎 周波 焦增富
单位：夏瑞祥 汪惠园(安徽医科大学第一附属医院血液科，合肥 230022)；汪渊 周青 刘虎(安徽医科大学分子生物学中心，合肥 230032)；周波(安徽省巢湖市中医院内科， 238000)；焦增富(淮南矿务局潘二谢三综合办医院，232000)
关键词：白血病；外淋巴细胞；急性
中图分类号 R733.71；R394.2
文献标识码 A 文章编号 1000-1492(2000)01-0076-01
p16基因位于染色体9 p21，它编码含有156个氨基酸残基、15.8 ku的蛋白质周期素依赖性激酶4抑制因子，其主要功能是将细胞阻滞在G1/S期交界点，一旦p16功能失活，细胞将发生无序扩增，可导致肿瘤发生，因而为一重要的抑癌基因，在人类多种恶性肿瘤频繁发生p16失活〔1〕。本课题对p16基因在急性白血病中的存在状态进行了系列研究，现将对我科收治的36例急性非淋巴细胞白血病(ANLL)p16基因缺失的研究结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 病例 根据FAB分型标准，结合细胞免疫表型，确诊36例ANLL，其中M1 2例，M2 16例，M3 6例，M4 4例，M5 8例，年龄12～73岁，平均年龄25岁。全部标本均采自化疗前初诊病人富含白血病细胞的外周血或骨髓，分离单个核细胞，备用。
1.2 主要试剂和仪器 引物由上海精工生物公司合成，Taq DNA聚合酶、dNTP等购自华美生物工程公司，Hema480基因扩增仪为珠海黑马医学仪器有限公司产品。
1.3 DNA提取 按常规酚—氯仿提取白血病细胞悬液基因组DNA，定量后，以ddH2O稀释到50 g·L-1备用。
1.4 PCR分析 根据p16基因外显子2序列设计引物〔2〕，3端引物为5TGGCTCTGACCATTCT-GT，5端引物为3AGCTTTGGAAGCTCTCAG。根据CDK4基因序列设计引物，3端引物为5CATGTAGACCAGGACCTAAGG，5端引物为3GGAGGTCGGTACCAGAGTG。取0.1 μg白血病基因组DNA加入PCR反应液(10 mmol·L-1 Tris,50 mmol·L-1 KCl, 2 mmol·L-1 MgCl2，200 μmol·L-1 dNTP，0.5 μmol·L-1引物)，p16和CDK4为单独反应体系，其中CDK4为模板DNA对照。每次实验均设p16阳性和阴性对照。共进行35个循环。取8 μl PCR反应液进行20 g·L-1琼脂糖电泳，以出现390 bp特异性扩增带为阳性结果。
2 结果
对36例ANLL标本检测显示，只有3例未出现扩增条带。
3 讨论
p16突变主要发生在外显子2，一般认为外显子2可反映p16基因缺失与否，大约50%的肿瘤细胞系存在p16基因缺失，但有报道在原代急性白血病p16基因缺失发生较低〔1，3，4〕，我们的结果也显示，ANLL病人具有较低的p16基因缺失，与文献报道基本相符。而在急性淋巴细胞白血病(ALL)中有20%～80%的p16基因缺失〔5〕，我们对40例ALL的研究结果(另作报道)证实，15例有p16基因缺失。这些结果提示，p16基因缺失在ANLL的发生中可能不起主要作用。我们将在今后的研究中进一步探讨p16基因失活与急性白血病尤其是ALL的发生、治疗与预后等关系，并对基因调控作深入研究。
基金项目：安徽省教委重点科学研究基金(JL-96-077)和安徽医科大学第一附属医院博士科研基金资助
作者简介：夏瑞祥，男，38岁，博士，副主任医师
参考文献
1，Nobori T, Mirua K, Wu DJ. Deletions of the cyclin dependent kinase-4 inhibitor gene in multiple human cancers. Nature,1994;368(6473):753～756
2，Surrano M, Hannon GJ, Beach D. A new regulatory motif in cell cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4. Nature,1993;366(6456):704～707
3，Hirama T, Koeffler HP, Bhat RA et al. Role of the cyclin-dependent kinase inhibtors in the development of cancer. Blood,1995;86(2):841～854
4，Quelle DE, Cheng M, Fagg GE et al. Cancer-associated mutations at the INK4a locus causes cell cycle arrest by p16INK4a but not by the alternative reading frame protein p19ARF. Proc Natl Acad Sci USA,1997;94(2):669～673
5，Ogawa S, Hirano N, Sato N et al. Homozygous loss of the cyclin-dependent kinase 4-inhibitor(p16) gene in human leukemia. Blood,1994;84(8):2431～2435
1999-05-20收稿，1999-08-30修回
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