IL-1与IL-2联合激活的骨髓对白血病细胞的净化作用

临床血液学杂志 2000年第6期第13卷 临床研究

作者：刘汉芝　韩俊领　冯四洲　李成文　李新　韩明哲

单位：中国医学科学院　中国协和医科大学　血液学研究所血液病医院 天津，300020

关键词：白细胞介素-1；白细胞介素-2；白血病细胞；骨髓；净化

　　摘要　目的：体外观察白细胞介素-1(IL-1)对白细胞介素-2(IL-2)激活骨髓自然杀伤细胞(NK)和淋巴因子-激活杀伤细胞(LAK)活性的影响及两者联合激活的骨髓对白血病细胞的净化作用。方法：标准4 h ⁵¹　Cr释放实验测定激活骨髓的细胞毒作用；集落培养法观察激活骨髓对HL-60和K562细胞的净化作用。结果：10～200 μg/L IL-1对正常骨髓的NK和LAK活性无明显影响；IL-2能够增强骨髓的NK活性和诱导LAK细胞的产生，呈浓度递增趋势；100 μg/L IL-1能增强1万～100万U/L IL-2诱导的骨髓NK及LAK活性。在体外净化实验中，100 μg/L IL-1或100万U/L IL-2对K562和(或)HL-60细胞无直接杀伤，而在掺入1% K562或HL-60的正常骨髓中，加入IL-1和(或)IL-2，对白血病细胞均有明显的毒性作用，以培养3 d的骨髓净化作用最强。IL-2的净化效果优于IL-1(P＜0.05)。两者联合激活的骨髓净化作用更为明显，1 d和3 d分别比单用IL-2增加1～2个对数级，差异有显著性(P＜0.05)。IL-1和(或)IL-2对激活骨髓的CFU-GM水平无明显影响。结论：IL-1能够明显增强IL-2激活的骨髓对白血病细胞的净化作用。

The purging effect of IL-1 and IL-2 activated bone

　　marrow on leukemic cells

LIU Han-zhi　HAN Jun-ling　FENG Si-zhou　LI Cheng-wen　LI Xin　HAN Ming-zhe

　　(Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital, CAMS and PUMC,Tianjin 300020)

　　Abstract　Objective:To investigate the activity of NK and LAK of IL-1 and IL-2 activated bone marrow (ABM) and the purging effect of the ABM on leukemic cells in vitro.Method:Determining the cytotoxic activity of ABM using standard ⁵¹　Cr release assay on 4 hours; evaluating the purging effect of ABM on HL-60 and K562 cells by semi-solid colony assay.Result:10-200 μg/L IL-1 does not affect the activity of NK and LAK of normal bone marrow;IL-2 can enhance the activity of NK and induce producing LAK cells in a dose-dependent manner；100 μg/L IL-1 can increase the activity of NK and LAK induced by 10～1 000 u/ml IL-2.100 μg/L IL-1 or 1000 u/ml IL-2 have no killing effect on K562 and /or HL-60 cells. Combining normal bone marrow and 1% K562 and /or HL-60 cells and cultured with IL-1 and/or IL-2 has significant cytotoxic activity on leukemic cells, the purging effect reach climax on day 3.The purging effect of IL-2 is superior to IL-1 (P＜0.05).The combination of the two cytokins can more effectively maintain the purging effects of ABM on leukemic cells, which can increase 1-2 logs compare with IL-2 alone on day 1 and day 3 (P＜0.05).IL-1 and/or IL-2 have no effect on CFU-GM of ABM.Conclusion:IL-1 can significantly enhance the purging effect of IL-2 activated bone marrow on leukemic cells.

　　Key words　Interleukin-1　Interleukin-2　Leukemic cell　Activated bone marrow　Purging

　　骨髓移植是治疗恶性血液病的有效方法之一，由于回输骨髓中残留的白血病细胞而复发率高于异基因骨髓移植。虽然有诸多方法用于骨髓净化，但一般特异性较差，易损伤干细胞而造成骨髓移植失败。近年来发现白细胞介素-2(IL-2)激活的骨髓(ABM)能够有效地杀灭白血病细胞，而不抑制造血祖细胞活性，且IFN-α、TNF等因子与IL-2具有协同增强ABM活性作用^〔1〕。我们选用白细胞介素-1(IL-1)与IL-2联合，观察其对IL-2激活骨髓净化作用的影响。

　　1　材料与方法

　　标本与细胞系：10例正常骨髓取自正常献髓者及非恶性血液病患者。K562、HL-60和Daudi细胞系为本室保存的细胞系。细胞系用含15%胎牛血清(FCS)的RPMI1640(Sigma公司)培养基培养，取指数生长的细胞进行实验。重组白细胞介素-1β(IL-1β)由日本北海道大学医学部馈赠，重组白细胞介素-2(IL-2)购自中国科学院生化所。⁵¹Cr购于美国杜邦公司。

　　ABM的诱生：取骨髓10 ml，按常规分离单个核细胞，洗3次后计数。将2×10⁶细胞加于含20% FCS，IL-1β(100 μg/L)和(或)IL-2(1万～100万U/L)的1640培养液中。于37℃、5% CO₂全湿培养，在不同时间测定NK及LAK细胞活性。

　　NK及LAK活性测定：按标准的4 h ⁵¹　Cr释放试验，参见文献〔2〕。选用对NK细胞敏感的K562细胞作为测定NK活性的靶细胞，耐NK的Daudi细胞作测定LAK活性的靶细胞。每次自然释放率＜15%,效靶比为20∶1。

　　净化方法：将浓度为2×10⁹/L骨髓细胞加至含有或无IL-1(100 μg/L)和(或)IL-2(1 000 U)RPMI 1640完全培养基中，掺入2×10⁴个对数生长的K562或HL-60细胞。置于37℃、5%CO₂中孵育3 d，每组取不同体积的液体做CFU-K562或CFU-HL-60培养,即根据预实验各组的净化效能，加入数倍于对照组体积的细胞悬液。同时设未掺入白血病细胞组，观察IL-1和(或)IL-2对CFU-GM的影响。

　　CFU-GM和CFU-K562、CFU-HL-60细胞的培养参见文献〔3〕。

　　IL-1和(或)IL-2对白血病细胞的影响：将2×10⁷/L K562或HL-60细胞于完全培养液中，加入IL-1 100 μg/L和(或)IL-2 100万U/L，隔天计数细胞数并接种半固体，观察其对白血病细胞生长的影响。

　　统计学分析：每项实验至少重复5次以上。NK和LAK用方差分析，净化效果用配对T检验。

　　2　结果

　　2.1　IL-1和(或)IL-2对K562和HL-60细胞增殖的影响

　　将100 μg/L IL-1和(或)100万U/L IL-2加入K562或HL-60细胞悬液中，隔天细胞计数，并用集落法测定二者对白血病细胞增殖能力的影响，结果表明(数据未列出)，此剂量IL-1和(或)IL-2对K562和HL-60细胞的增殖无明显影响(P＞0.05)。

　　2.2　IL-1和(或)IL-2激活骨髓的NK及LAK活性

　　4 h ⁵¹　Cr释放试验显示，1～200 μg/L IL-1有增强骨髓对NK敏感K562和耐NK Daudi细胞的杀伤的趋势，而1万～200万U/L IL-2能够增强骨髓NK或诱导骨髓LAK活性的产生,呈剂量依赖性。100 μg/L IL-1与1万～100万U/L IL-2二者联合激活的骨髓的NK及LAK活性，明显优于IL-2单用（P＜0.05）。

　　用50万U/L IL-2或IL-2联合100 μg/L IL-1,观察激活骨髓的NK及LAK活性的时间效应,结果显示3 d强于1 d（P＜0.05），联合组均优于IL-2单用组（P＜0.05），见图1。

图1　ABM细胞毒性时间效应

　　2.3　IL-1和IL-2激活的骨髓净化作用

　　在加入100 μg/L IL-1及100万U/L IL-2激活的骨髓掺入1%的K562或HL-60细胞，培养1～3 d，观察上述两种因子单独或联合激活的骨髓对白血病细胞净化的作用（表1）。实验结果显示：激活的骨髓对白血病细胞均有杀伤作用，培养3 d的活性明显高于1 d。100 μg/L IL-1激活的骨髓对白血病的净化作用，虽然培养3 d ABM的净化效能强于1 d，但均低于1个对数级；IL-2　1 d ABM杀伤为0.89个对数级，3 d为2.11个对数级，优于IL-1（P＜0.05）；而二者联合的ABM 1 d和3 d分别比单用IL-2增加1～2个对数级，差异有显著性(P＜0.05)。

表1　IL-1和(或)IL-2激活的骨髓的净化效果比较　%

　　2.4　IL-1和(或)Il-2对正常骨髓CFU-GM的作用

　　在正常骨髓中加入IL-1和(或)IL-2，与骨髓MNC一起孵育不同时间，分别测其CFU-GM(表2)。与0 d对照骨髓相比，不加因子组、IL-2或二者联合1～3 d的CFU-GM无显著下降（P＞0.05），5 d时集落均明显下降，为0 d的20%～30%左右（P＜0.05）。

表2　正常骨髓中加入IL-1和(或)IL-2后CFU-GM的测值比较

　　集落数/2×10⁵ MNC

　　3　讨论

　　免疫或生物治疗已成为抗肿瘤治疗的新方法，IL-2在机体免疫应答中起关键作用。许多研究表明用IL-2激活的周血淋巴细胞能够选择性的杀伤骨髓中的白血病细胞，且IL-1、IFN、TNF与之有协同作用，而IL-2激活的骨髓对肿瘤细胞的杀伤强于激活的周血淋巴细胞^〔4，5〕。在我们的⁵¹Cr释放实验中，IL-2激活的骨髓对NK敏感和耐NK白血病细胞均有杀伤作用，IL-1虽不能明显地影响骨髓的NK和LAK活性，但能增强IL-2激活的骨髓杀伤活性，即增强ABM对白血病细胞的杀伤作用。

　　目前，已有多种方法用于自体骨髓移植中白血病细胞的净化，但均存在限制因素。IL-2诱导的ABM对白血病细胞有杀伤作用，且不会影响造血、不受白血病细胞表面抗原的限制，具有广谱的抗肿瘤特性。我们进行净化实验结果显示：IL-1和(或)Il-2对K562或HL-60细胞的生长无直接影响，而在分别掺入1%上述两类白血病细胞的骨髓中加入IL-2，在1～3 d加IL-2组，1 d激活骨髓即有明显的杀伤活性，K562或HL-60集落仅为对照的4.5%～13.3%， 3 d时效果更佳，为0.14%～0.22%。

　　利用药物、加热、生物制剂本身或相互联合净化以最大程度地杀灭骨髓中残留的白血病细胞，是目前研究的热点之一。IL-1是一种具有广泛生物活性的细胞因子，免疫调节作用是其主要功能之一，它通过直接细胞毒性效应，激活免疫细胞一级诱生其它肿瘤杀伤因子或增强其对肿瘤细胞的杀伤能力；此外，IL-1还参与造血等多种生理功能。在我们的实验中，IL-1对骨髓的NK及LAK活性无明显增强作用，而在净化实验中，其对K562或HL-60细胞均有杀伤作用，培养1 d白血病集落为对照的38.0%～90.3%，3 d时为9.6%～57.5%，其净化效果明显低于IL-2激活的ABM。两者联合激活的骨髓的净化能力比单用IL-2明显提高，培养1 d的白血病细胞集落为对照的0.24%～0.40%，3 d为0～0.014%。这表明两者联合在不增加IL-2浓度情况下，能增强IL-2诱导的ABM对白血病细胞的杀伤力，获得最佳的净化效果。此外，表2表明IL-1、IL－2及两者联合对造血祖细胞无影响，而对白血病细胞有特异的杀伤作用。

　　综上所述，IL-1和(或)IL-2激活的骨髓对K562或HL-60细胞均有净化效果，以联合组效果最佳，有协同作用，且培养1～3 d对造血细胞无明显影响。这一结果可能为自体移植的体外净化或白血病缓解期IL-1和IL-2体内免疫治疗提供理论依据。参考文献

　　1，Charak B S,Agah R,Gray D,et al.Interaction of various cytokines with interleukin 2 in the generation of killer cells from human bone marrow:Application in purging of leukemia.Leuk Res,1991,15:801～810

　　2，Beckner S K,Maluish A E,Longo D L.Lymphokine-activated killer cell:Culture conditions for the generation of maximal in vitro cytotoxicity in cells from normal donors.Cancer Res,1987,47:5504～5508

　　3，李成文，严文伟，郝玉书，等.干扰素α和白细胞介素2联合激活的白血病骨髓对K562细胞的杀伤作用.中华血液学杂志，1997，18：410～412

　　4，Grump W L,Owen-Schaub L B,Grimm E A.Synergy of human recombinant interleukin 1 with interleukin 2 in the generation of lymphokine-activated killer cells.Cancer Res,1989,49:149～153

　　5，Charak B S, Malloy B, Agah R M.A novel approach to purging of leukemia by activation of bone marrow with interleukin 2. BMJ，1990,6:193～198

(收稿 2000-02-25)