急性白血病患者周期素D₁及其激酶抑制蛋白p15检测的意义

临床血液学杂志 2000年第6期第13卷 临床研究

作者：林凤茹　卫俊萍　郭晓楠　张学军　谢寒静　杨林　董作仁　姚尔固

单位：河北医科大学第二医院血液病研究所 石家庄，050000

关键词：细胞周期素D_{1<；sub>；周期素依赖性激酶抑制蛋白；流式细胞术；急性白血病}

　　摘要　目的：探讨细胞周期素D₁及其激酶抑制蛋白p15表达在急性白血病（AL）中的临床意义。方法：用间接免疫荧光标记流式细胞术研究46例初治AL细胞治疗前后D₁、p15、细胞周期及DNA倍体与疗效间关系。结果：28例急性髓系白血病（AML）中22例p15阳性，6例阴性。18例急性淋巴细胞白血病(ALL)中p15均阳性。AML与ALL D₁均阳性。高p15者G₁期细胞百分率(G₁%)增多，S期细胞百分率(S%)减少。低p15者G₁%减少，S%增多。DNA非整倍体者均高表达p15和D₁，完全缓解率低（30%）。高p15低D₁者20例中18例（80%）完全缓解(CR)；低p15高D₁者10例，8例（80%）CR；高p15高D₁者14例中10例（71.4%）CR，低p15低D₁者2例均CR。结论：p15和D₁在AL中表达有异质性。高p15者显示G₁期阻滞，低p15显示G₁/S期转化，p15和D₁表达有助于指导治疗。

Clinical significance of the expression of cyclin D₁ and

　　its kinase inhibitor p15 in acute leukemia

LIN Feng-ru　WEI Jun-ping　GUO Xiao-nan　ZHANG Xue-jun

　　XIE Han-jing　YANG Lin　DONG Zuo-ren　YAO Er-gu

　　(Institute of Hematology,the Second Affiliated Hospital,Hebei Medical University,Shijiazhuang 050000)

　　Abstract　Objective:To study the clinical significance of cyclin D₁ and its kinase inhibitor p15 expression in acute leukemia(AL).Method:Using indirect immunofluorescence labelling,the expression of D₁ and p15 ,cell cycle,DNA ploidy and their relation to therapeutic effect were studied by flow cytometry in 46 cases of AL de novo.Result:In 28 AML cases, 22 were positive for p15,and 6 negative.All of 18 ALL cases showed positive for p15,All AML and ALL cases expressed D₁. The percentage of cells in G₁ phase increased and that of cells in S phase decreased in cases with high p15.the percentage of cells in S phase increased and that in G1 phase decreased in cases with low p15. Both high expression in p15 and D₁ occurred in DNA an euploidy cases with low complete remission rate (CR,30%).In 20 cases with high p15 and low D₁,16(80%) entered CR; in 10 with low p15 and high D₁,8(80%) CR; in 14 with both high p15 and D₁,10(71.4%) CR, and in 2 with both low p15 and D₁, 2 CR.Conclusion:The expression of p15 and D₁ showed heterogeneity. High p15 cases exhibited G₁ arrest ,while low p15 expression rendered the cell cycle transition from G₁ to S phase . Their expression is helpful to design therapeutic regimen.

　　Key words　Cyclin D₁　Cyclin-dependent kinase inhibitor　Flow cytometry　Acute leukemia

　　细胞周期的调节主要依靠周期素（cyclin），周期素依赖性激酶(cyclin-dependent kinase , CDK)及CDK抑制蛋白（CDKI）相互作用而正常进行，其失控可致肿瘤发生^〔1〕。我们用流式细胞术（FCM）分析急性白血病(AL)周期素D₁和CDKI p15 INK4B （p15）的表达及其临床意义。

　　1　资料与方法

　　1.1　临床资料

　　46例AL系初治住院患者，男32例 ，女14例；年龄16～70岁，平均40岁。均经细胞形态学、细胞化学及免疫表型而确诊。分型计急性淋巴细胞白血病（ALL）18例（L₁7例，L₂11例），急性髓系白血病（AML）28例（M₂8例，M₃4例，M₄6例，M₅8例，M₆2例）。治疗方案：ALL用COADP方案，AML中M₃以RHA方案(全反式维甲酸30 mg/(m²*d)，直至缓解，高三尖杉酯碱和阿糖胞苷。

　　疗效按国内统一标准评定，分完全缓解(CR)，部分缓解(PR)和未缓解(NR)。

　　1.2　检测方法

　　白血病细胞悬液按我所方法进行制备^〔1，2〕，检测前悬液浓度调整至1×10³/L。

　　DNA含量测定按我所方法进行，以DNA指数DI表示细胞DNA相对含量，DI为1.0±0.1(±2s)为正常二倍体，DI不在其中或与此无倍数关系则为DNA非整倍体^〔1，2〕。

　　周期素D₁采用间接免疫荧光法标记。取白血病细胞悬液，以PBS液洗涤离心(1 000 r/min,2 min)2次，弃上清液。加入1∶400稀释的鼠抗人周期素D₁的单克隆抗体(Clone ZY-7D₂，Lot NO,71139711,ZYMED Laboratory INC,USA)100 μl。在37℃水浴中温育30 min。如前述洗涤离心两次后，弃上清液。加第2抗体1∶20稀释的羊抗鼠FITC-IgG(北京军事医学科学院微生物研究所，批号9109)100 μl。于37℃水浴中温育30 min，离心，弃上清液。用PBS液洗涤离心两次，弃上清液，加1 ml PBS液经400目滤网过滤后即可上FCM检测。

　　免疫荧光染色白细胞涂片在荧光显微镜下观察，细胞浆染绿色荧光表示D₁阳性。

　　D₁相对含量以荧光指数FI表示，按Morkve等公式^〔3〕计算：

　　(白血病细胞D₁表达的平均荧光强度-对照样品平均荧光强度)/(正常人淋巴细胞D₁表达的平均荧光强度)

　　FI＞1.0为阳性表达，≥1.30为高表达，＜1.30为低表达，≤1.0为阴性。

　　p15标记采用间接免疫荧光法标记。用羊抗人p15单克隆抗体(R-20-G，Santa Cruz,USA)标记方法及第2抗体同D₁。免疫荧光染色后白细胞涂片在荧光显微镜下观察，细胞浆染绿色表示p15阳性，其相对含量亦以FI表示，计算用morkve等公式^〔3〕，FI＞1.0为阳性表达，≥1.30为高表达，＜1.30为低表达，≤1.0为阴性。细胞周期分布按我所方法算出细胞周期的分布百分比^〔1，2〕。

　　统计学处理以t检验和χ²检验，各参数以±s表示。

　　2　结果

　　2.1　白血病类型与p15、D₁表达和细胞周期

　　28例AML，p15阳性22例，阴性6例，D₁均为阳性。18例ALL p15和D₁均阳性。46例AL中高表达p15 34例，低表达p15 6例，阴性6例。高表达D₁24例，低表达D₁22例。28例AML p15 FI含量1.29±0.13，D₁FI含量1.26±0.14，细胞周期G₁期(80.76±4.92)%，S期(11.87±2.9)%，G₂/M期(7.36±2.51)%；18例ALL p15和D₁ FI含量分别为1.31±0.17和1.33±0.17，G₁、S和G₂/M期细胞分别为(80.17±5.7)%、(11.82±2.5)%和(8.28±3.51)%。经统计学处理，AML与ALL表达p15、D₁及细胞周期分布无差异(P＞0.05)。表1显示治疗前及治疗后p15、D₁细胞周期的变化。由于病例较少，未作白血病各亚型间p15、D₁细胞周期的分析。

表1　AL患者治疗前后p15、D₁细胞周期测值±s

　　CR者p15和D₁有所减低，但与治疗前差异不明显(P＞0.05)，NR者比治疗前表达p15和D₁有所增强，亦无差异(P＞0.05)，细胞周期分布亦无明显改变。

　　2.2　疗效与p15、D₁表达

　　46例AL患者中36例(78.3%)CR；18例ALL中16例(88.9%)CR，28例AML中20(75%)CR。将46例AL患者按p15、D₁的表达与疗效的关系分为四组分析：第1组为高p15低D₁者20例，16例(80%)CR，4例NR；第2组为低p15高D₁者10例，8例(80%)CR，2例NR；第3组为高p15高D₁者14例，10例(71.4%)CR，4例NR；第4组为低p15低D₁者2例，全部CR。经统计学处理各组间CR无差异(P＞0.05)，提示p15、D₁表达虽有异质性，但对疗效无明显影响。由于观察时间较短(4～16个月)尚无复发病例。4组p15、D₁表达与细胞周期见表2。

表2　46例AL患者治疗前p15、D₁表达与细胞周期测值±s

　　表2提示高表达p15者G₁%较高，而S期和G₂/M期细胞百分率较少，尤其合并低D₁者。低表达p15者无论D₁表达高或低，S%较高，G₁%较低。经统计学处理差异有显著性(P＜0.01)。

　　2.3　p15、D₁表达与DNA倍体

　　46例AL治疗前DNA整倍体者32例，其p15和D₁表达FI分别为1.29±0.14和1.29±0.15。DNA非整倍体者14例，其p15、D₁表达FI分别为1.36±0.05(范围1.32～1.45)和1.40±0.09(范围1.31～1.57)，均为高表达。治疗前DNA非整倍体者14例，经治疗达到CR后12例转为整倍体，2例仍为非整倍体，但p15、D₁表达均减低，分别为0.95±0.11和1.01±0.02。10例NR者7例治疗前为非整倍体。提示非整倍体者均高表达p15和D₁，多不易缓解。治疗后非整倍体可转为整倍体。

　　3　讨论

　　众所周知，细胞周期的调控复杂，主要受周期素，CDK及其抑制蛋白CDKI的相互作用所影响。调控G₁期向S期的转化，主要是D₁，其上调使细胞自G₁期进入S期，反之细胞阻滞于G₁期^〔4〕。其活化为肿瘤发生的重要原因之一^〔5〕。CDKI亦有多种，p15(p15INK4B，CDKN2B，MTS2)抑制CDK4/6使CDK不能与D₁形成D₁/CDK4/6复合物，因而细胞学阻于G₁期^〔6〕。Quesnel等^〔6〕发现53例MDS原始细胞＞10%者24例中(包括9例转为AML)有p15甲基化，而原始细胞＜10%者无此现象，而且原始细胞逐渐增多，p15甲基化随之发生，提示p15甲基化对MDS向白血病转化有重要的作用。慢性B淋巴细胞白血病患者很少有p15甲基化^〔7〕故而进展缓慢。在54例T细胞ALL患者中61%有p15改变，而复发35例中57%有p15改变，常同时有p16(p16INK4A，CDKN2A，MTS1)改变^〔8〕。其变化不影响初治CR，有p15改变者复发后生存期短均于18个月内死亡^〔8〕。本组46例AL，AML和ALL均表达D₁，而p15表达绝大多数阳性，仅6例阴性，表达与外周血细胞数、肝、脾、淋巴结肿大，骨髓原始细胞百分率无明显相关。随访期间尚未见复发。

　　我们发现p15和D₁表达有异质性。高表达p15尤其伴低表达D₁者有G₁期阻滞，G₁%明显增多，S期细胞明显减少；而低和不表达p15伴高表达D₁者则相反，显示G₁/S期转化。高p15高D₁者也有G₁期阻滞，S期细胞亦多于高p15低D₁者，p15虽高但不是以完全抑制高D₁使进入S期细胞增加。低p15低D₁显示G₁/S转化，可能D₁表达虽低，但对低和不表达p15而言D₁相对高，故也有G₁向S期转化。支持D₁在细胞周期改变与肿瘤发生中的重要性^〔5〕。

　　细胞周期的调控极其复杂。我们所观察p15和D₁仅为复杂细胞周期G₁期调控众多因子中的一小部分，但是主要的。细胞周期的调控是众多周期素，CDK和CDKI间相互作用的结果，全面揭示白血病细胞周期调控机制，需要作进一步的深入研究。参考文献

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(收稿 2000-01-12)