急性白血病bcl-2表达及其临床意义

中华血液学杂志 1999年第7期第20卷 研究报告

作者：温宏升　夏薇　盛瑞兰　朱广荣　吴雨洁

单位：夏薇　盛瑞兰　朱广荣　吴雨洁　南京医科大学第一附属医院210002；温宏升　空军南京医院210002

　　我们用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法对50例急性白血病(AL)患者中bcl-2的表达水平进行了检测，并分析它与AL临床特征、化疗反应及mdr1基因间的关系。

　　病例和方法

　　1　病例与对照50例AL患者均为我院住院病例，其中急性髓系白血病(AML)31例(初发22例，复发9例)，急性淋巴细胞白血病(ALL)10例，慢性髓细胞白血病（CML）急变5例，非霍奇金淋巴瘤白血病（NHL→ALL）4例。对照组8例，其白细胞系统均无异常。初发性AML采用DA、HA或MA方案化疗，其中M3型加用维甲酸；ALL用DOLP方案化疗；复发难治性AL用Vm26＋阿糖胞苷（Ara-C）或足叶乙甙（Vp16）＋Ara-C方案化疗。疗效判断按文献^[1]。

　　2　引物与细胞株

　　2.1　引物：bcl-2和β2微球蛋白(β2-MG)引物参见文献[2]，均在美国Cybersyn公司合成。bcl-2引物序列:5'-GGACAACATCGCCCTGTG-3'(551～568),5'-AGTCTTCAGACAGACAGCCAGGA-3'(668～688)，扩增片段137bp；作为阳性对照的bcl-2cDNA由南京铁道医学院黄晓明博士惠赠。

　　2.2　细胞株：HL-60及K562均由南京铁道医学院血液病研究室惠赠。

　　3　标本采集　取初诊患者化疗前骨髓2～4ml，分离单个核细胞，细胞总数要求在（3～5)×105，直接提取RNA。

　　4　RT-PCR　用标准的异硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法(AGPC法)提取RNA。紫外分光光度计定量，并要求A260：A280＞1.8。

　　逆转录合成cDNA：反应体系40μl，含总RNA1μg，RNasin40U，5×M-MLV逆转录反应缓冲液8μl(Tris-HCl250mmol/L,pH8.3;KCl375mmol/L;MgCl215mmol/L),4×dNTP各40nmol，DTT0.2μmol，随机引物500ng，M-MLV逆转录酶200U。逆转录条件：65℃5分钟，冰浴3分钟，加M-MLV逆转录酶，37℃60分钟，72℃10分钟。

　　PCR扩增：反应体系25μl,含10×PCR反应缓冲液2.5μl(Tris-HCl10mmol/L,pH8.4; MgCl21.5mmol/L; KCl50mmol/L; PAS20μg/ml)，2.5mmol/LMgCl2溶液1μl，4×dNTP各20nmol，Taq酶1U，bcl-2引物40pmol，β2-MG引物40pmol，逆转录产物4μl(100ngRNA来源的cDNA)或bcl-2cDNA(25ng/μl)2μl(作为阳性对照)。多次扩增均阴性的标本作为阴性对照1，不加逆转录酶而得到的标本作为阴性对照2。扩增条件：95℃10分钟后，冷却至80℃，加Taq酶94℃变性1分钟、55℃退火1分钟、72℃延伸1分10秒，在PCR扩增仪上循环39次，再72℃20分钟。

　　5　PCR产物检测及半定量　取10μl扩增产物，60g/L聚丙烯酰胺电泳，溴乙锭染色，紫外灯下观察结果并照像，用光密度扫描仪测A值，并计算bcl-2和β2-MG条带密度比值（bcl-2/β2-MG）作为bcl-2的相对表达强度。

　　6　统计处理　采用方差分析、χ2检验、t检验、等级相关分析。

　　结果

　　1　正常对照、细胞株及患者bcl-2基因表达的特点　8例正常对照者骨髓单个核细胞中bcl-2mRNA的相对表达强度为0.16±0.11，50例ALL为0.70±0.73，两组比较差异极为显著(P〈0.001)，将相对表达强度≥0.3定为bcl-2阳性，则AL中bcl-2阳性率为68％。K562细胞株中未见bcl-2条带；HL-60细胞株bcl-2相对表达强度为0.40±0.12(n="4)。"bcl-2cDNA扩增后可见清晰的137bp的bcl-2条带，无β2-MG条带（见图1）。

　　1:阴性标本；2，5：阳性对照；M：pGEM-7zf(＋)/HaeⅢDNAMarker；3,4:阳性标本。137bp:bcl-2条带；114bp:β2-MG条带

　　图1　bcl-2基因RT-PCR扩增产物电泳

　　2　bcl-2mRNA的表达与AL分型的关系　AML、ALL与正常对照相比，bcl-2的阳性率和阳性强度均显著升高(P〈0.01～0.005)。AML与ALL相比，bcl-2阳性率和相对阳性强度差异均无显著性。CML急变5例中1例阳性，阳性强度0.20±0.45，呈低表达趋势；NHL→ALL4例均阳性，阳性强度2.05±1.48，呈显著高表达趋势。M43例、M51例、M62例bcl-2表达强度分别为0.38±0.40；0.4；1.19±0.35；M1亚型较其它亚型具有bcl-2高表达的倾向，M3亚型较其它亚型具有低表达的倾向(表1)。

表1　AL亚型bcl-2mRNA表达

　　注：AML亚型间比较，＊P＞0.05

　　3　AL中bcl-2表达与分化抗原的关系　共有19例患者(ALL8例，AML11例)作了免疫分型，CD13、CD33、CD9、CD10、CD14、CD15、CD34、DR等各分化抗原阳性组、阴性组相比,bcl-2的表达水平差异无显著性(P＞0.05)，bcl-2表达与以上各抗原间无相关。

　　4　bcl-2表达与化疗反应的关系　31例AML患者中bcl-2阳性组完全缓解(CR)率(25.0％)显著低于bcl-2阴性组(77.8％)(P〈0.025)，CR组bcl-2阳性率和阳性强度均低于未缓解组，差异有显著性(P〈0.025)；初发组和复发组bcl-2阳性率和阳性强度差异均无显著性(表2)。10例ALL中bcl-2阳性组和阴性组CR率差异无显著性。

表2　AML患者中不同化疗反应组bcl-2表达

　　注：＊与CR组比较，P〈0.025；＃与初发组比较，P＞0.05

　　5　AML患者bcl-2与mdr1表达　31例AML患者中23例同时用RT-PCR方法检测了多药耐药基因mdr1的表达，发现bcl-2阳性组和阴性组mdr1的阳性率(52.9％和33.3％)差异无显著性(P＞0.05)，计算等级相关系数rs=0.360，P＞0.05，说明bcl-2与mdr1间存在正相关倾向。

　　讨论

　　本实验结果表明，大多数类型AL中存在bcl-2的高水平表达，NHL→ALL有更高表达倾向。在淋巴瘤中bcl-2阳性表达常伴有染色体易位或其它类型的基因结构异常，而在AL中极少见，这些异常结构的存在可激活bcl-2基因,导致bcl-2基因的过度表达^[3]。

　　大量体外、体内实验表明，白血病中bcl-2的高表达与其对化疗、放疗的抵抗有关，但相反的报道也存在。本研究结果表明，AML中bcl-2表达水平与化疗反应显著相关，但ALL患者bcl-2表达与化疗CR率无明显相关，可能其它凋亡相关基因影响bcl-2的作用。初发性和复发性AML中bcl-2水平无显著差异。我们认为bcl-2主要是决定白血病细胞内在易凋亡性的指标，其表达不依赖化疗药物的诱导。bcl-2介导耐药的机制和阻止药物进入细胞内或改变药物介导损伤的修复无关，而和延长细胞的存活期有关。在延长的存活期内，肿瘤细胞可发生生化或遗传学的改变，从而按经典方式产生耐药，或者只是使药物损伤的肿瘤细胞存活到药物作用消失后，从而得到自我修复，恢复正常功能。

　　我们发现bcl-2与mdr1并无相关性。bcl-2和mdr1通过不同机制引起化疗耐药，mdr1在复发性AML患者中明显升高，而bcl-2在初发和复发AML中差异无显著性，可能mdr1主要与获得性耐药相关，bcl-2主要与原发性耐药相关。

　　参考文献：

　　1　Quattrone A, Papuci L, Santiai S, et al. Quantitation of bcl-2 oncogene in child lymphoma/leukemia cell lines and primary,luekmia B-cells by a highly sensitive RT-PCR mothod. Haematologica.1995,80:495-504.

　　2　张之南,沈悌，主编.《血液病诊断及疗效标准》.第2版.北京:科学出版社,1998.214-215.

　　3　Smith EC,Kitanka A,pin CH,et al.Clinical relevance of bcl-2 gene in child acute lymphocytic leukemia.Blood， 1996,87:1140-1145.

收稿：1998-07-14　　修回：1999-02-01

校对：徐丽娟