中期荧光原位杂交技术在t(8;21)白血病随访中的应用

中华血液学杂志 2000年第7期第21卷 研究报告

作者：沈美凤　过宇　虞斐　薛永权

单位：沈美凤（215004　苏州医学院附属第二医院血液科）；过宇（苏州医学院附属第一医院血液室）；虞斐（215004　苏州医学院附属第二医院血液科）；薛永权（苏州医学院附属第一医院血液室）

　　t（8;21）（q22;q22）是M₂型急性髓系白血病（AML）的特异性染色体重排，在分子水平上它导致AML₁-ETO融合基因形成，后者在t（8;21）白血病发病中起重要作用且可用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）进行检测。t（8;21）白血病经治疗获完全缓解（CR）后患者骨髓细胞核型通常转为正常，而RT-PCR检测部分患者仍为阳性，最长可至8年。因此，t（8;21）白血病患者AML₁-ETO阳性并不一定意味着有白血病复发的风险^［1］。中期荧光原位杂交（FISH）是利用非同位素物质如生物素、地高辛或异硫氰酸荧光素（FITC）标记的全染色体涂染探针（WCP），借助核酸杂交原理在中期细胞中检测染色体结构异常的分子-细胞遗传学新技术。近来有人报道应用中期FISH检测慢性粒细胞白血病和急性早幼粒细胞白血病的微量残留病（MRD）^［2-4］，国内尚未见用其检测t（8;21）AML MRD的系统报道。1997年以来我们应用该技术对1例初诊和12例CR中的t（8;21）AML患者进行了初步研究，评价其对检测t（8;21）白血病MRD的价值。

　　病例和方法

　　1　病例　13例均为1997年3月～1999年4月在江苏省血液病研究所和苏州市其它医院就诊的患者。男8例，女5例。年龄11～50岁，中位年龄33岁。根据临床表现、血象、骨髓象、免疫表型及细胞遗传学改变，13例均确诊为t（8;21）AML，其中例1为初诊，例2～12为第1次CR的患者，例13为第2次CR的患者。正常对照为染色体检查核型正常的骨髓标本。

　　2　染色体检查　采用直接法、短期培养法或采用高浓度秋水仙胺（浓度为0.01mg/ml）培养12h后^［5］，按常规收获细胞制备染色体标本并进行R显带处理^［6］。根据《人类细胞遗传学国际命名体制（ISCN）》^［7］的规定进行核型分析，每例患者至少分析15个以上中期细胞。剩余的细胞悬液储存于-20℃，以供FISH检测。

　　3　中期FISH　实验按Vysis公司产品说明进行：取出储存于-20℃的患者骨髓细胞悬液，更换新鲜配制的甲醇/冰醋酸（3∶1）固定液，冰片滴片，气干，标本在室温下老化2d后置72℃变性液（pH 7.0，体积分数为70%的甲酰胺/2×SSC）中变性5min，乙醇系列脱水，气干，在40～50℃铁板上预热；将含1μl Spectrum Orange 8 WCP（购自Vysis公司）、7μl杂交缓冲液及2μl双蒸水的探针杂交混合液离心混匀，在72℃水浴中变性5min后加在预热的玻片上，封片，37℃湿盒杂交过夜。杂交后采用快速洗涤法：在73℃ 含体积分数为0.3%的NP-40的0.4×SSC（pH 7.0）中洗2min，在室温下含体积分数为0.1%的NP-40的2×SSC（pH 7.0）洗5～10s。用含DAPI（浓度为0.1μg/ml）的抗褪色液复染标本；采用Olympus BX-60荧光镜观察，激发波长为520～550nm，阻滞波长为590nm。此时可见染色体及间期核呈蓝色，杂交信号为桔红色，选择典型细胞用Ektapress 400负片进行显微摄影。

　　4　RT-PCR　采用RT-PCR检测AML₁-ETO融合基因转录本。其方法简述如下：采用TRIZOL裂解液抽提总RNA，将RNA逆转录成cDNA。经二轮PCR扩增后，取PCR产物10μl于15g/L琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下观察结果并摄影。

　　引物序列为 A：5′-AGCCATGAAGAACCAGG-3′;

　　B: 5′-AGGCTGTAGGAGGGAATGG-3′;

　　C: 5′-CCCCGAGAACCTCGAAATCGT-3′;

　　D: 5′-GTTGTCGGTGTAAATGAA-3′。

　　结果

　　1　染色体检查　例1为初诊患者，其染色体核型为t（8;21）(q22;q22)，同时还伴有性染色体的丢失。例14为正常对照，染色体核型分析结果为正常女性核型。其余12例均为正常核型（表1）。

表1　13例t(8;21)AML患者和1例对照者的临床和实验室资料

　　注：CCR为持续完全缓解

2　中期FISH检查　阳性细胞表现为3个荧光信号，其中最大的信号为正常8号染色体，较小的信号为长臂部分缺失的8号染色体，另一个最小的信号为易位至21号长臂上的8号长臂末端部分。阴性结果为2个大小相同的杂交信号，即两条正常8号染色体。例1分析细胞均为阳性，例14为正常对照，结果为阴性，12例CR患者中3例（例4，5，7）检测呈阳性结果，其细胞阳性率分别为4.7%(分析43个细胞)、7.1%(分析56个细胞)、6.2%(分析306个细胞),上述患者分别在3个月、2.5个月及1个月后复发。其余中期FISH显示阴性结果的9例随访至今均处于持续CR状态（CCR）（表1）。

　　3　AML₁-ETO融合基因检测　受检测的8例患者中5例（例4，5，6，7，9）有AML₁-ETO融合基因转录本（表1）。

　　讨论

　　早期检测MRD是防止白血病复发和提高患者长期无病生存率的重要举措。目前，检测MRD的手段很多，如常规细胞遗传学、细胞培养法、流式细胞仪免疫标记检测、Southern blot法、RT-PCR、FISH等^［8］。常规细胞遗传学虽然能在单个细胞水平上检测有无t(8;21)存在，但由于受染色体显带质量好坏的影响，且通常只能分析少量分裂象(20～25个)，因此其检测MRD的敏感度甚差。本组12例CR患者骨髓细胞核型分析均为正常就证实了这一点。Southern blot敏感度只有1%～5%，并且只能反映白血病细胞群体的状态而缺乏定量分析的价值。RT-PCR的最大优点是灵敏度高，可达10^-5～10^-6，但也存在着假阳性和假阴性的可能，它也只能反映白血病细胞群体而非单个细胞水平的基因状态，是一种定性而非定量的指标。如前所述，t(8;21)白血病CR后RT-PCR检测仍可为阳性。本研究中尽管只有8例CR患者作了RT-PCR检测，结果5例检测到AML₁-ETO转录本，随访至今，其中中期FISH阳性的3例均已复发，而另2例仍处于CCR状态。这与文献报道结果一致^［1］。发生这一现象的原因目前尚不清楚。

　　中期FISH由于较少受中期分裂象质量和分散程度好坏的影响，只要见到三个荧光杂交信号即可有把握地确定t(8;21)的存在，并且可在短期内快速观察大量细胞，因此比常规染色体核型分析更为简便、快速、准确和敏感，尤其在采用了高浓度秋水仙胺作用后，分裂象明显增加，进一步提高了其检测MRD的灵敏度。中期FISH技术检测的是单个细胞水平上的染色体异常，因此可提供白血病负荷的数量指标，并且它反映的是增殖期细胞中的白血病残留状态，这种增殖期的细胞比非增殖的细胞更可能导致复发。本组1例初诊患者所分析的45个细胞均为阳性，而来自1名正常人的42个细胞均为阴性，提示本法不存在假阳性和假阴性可能。我们在国内首次应用中期FISH技术对t(8;21)白血病患者作了随访研究，结果12例CR患者3例(例4，5，7)分别检测出4.7％，7.1%和6.2%阳性细胞，且均在1～3个月内复发，另外9例中期FISH阴性患者随访至今仍处于CCR状态。这就有力地证明，中期FISH为t(8;21)白血病患者的MRD检测提供了一种快速、可靠和灵敏的手段，其阳性结果可准确地预测白血病的复发。

　　基金项目：江苏省卫生厅基金资助项目（H9702）

参 考 文 献

　　1，Nucifora G, Larson RA, Rowley JD. Persistence of the 8;21 translocation in patients with acute myeloid leukemia type M₂ long-term remission. Blood, 1993, 82:712-715.

　　2，Temperani P, Vaccari P, Giacobbi F, et al. Assessment of MRD in acute promyelocytic leukemia with t(15;17) by chromosome painting. Eur J Haematol, 1995, 55:10-13.

　　3，Lian Z, Chang KS, Estey EH, et al. Detection of residual leukemic cells in patients with acute promyelocytic leukemia by fluorescence in situ hybridization method: potential for predicting relapse. Blood, 1995, 85:495-499.

　　4，el-Rifai W, Ruutu T, Vettenranta K, et al. Minimal residual disease after allogeneic bone marrow transplantation for chronic myeloid leukemia: a metaphase-FISH study. Br J Haematol, 1996, 92:365-369.

　　5，Nylund SJ, Ruutu T, Sarinen U, et al. Metaphase fluorescence in situ hybridization (FISH) in the follow-up of 60 patients with haemopoietic malignancies. Br J Haematol, 1994, 88:778-783.

　　6，薛永权，过宇. 介绍一种改良的骨髓细胞染色体热变性姬姆萨R显带法. 中华医学检验杂志，1986，9：247-248.

　　7，Mitelman F， ed. Guidelines for Cancer Cytogenetics, supplement to an International System for Human Cytogenetic Nomenclature(ISCN).New York: Karger, 1991.

　　8，Campnna D, Pui CH. Detection of minimal residual disease in acute leukemia: methodology advances and clinical significance. Blood, 1995, 85:1416-1434.