用PCR检测29例白血病患者微卫星杂合性丢失

中华血液学杂志 1998年第12期第19卷 研究报告

作者：朱平　王黎明　符粤文　刘迎　薛海鹏　虞积仁

　　许多肿瘤都发现存在微卫星的杂合性丢失（loss of heterozygosity，LOH)现象^［1］。基因丢失的部分往往存在抑癌基因。白血病常有染色体易位，形成易位的断裂点区域抑癌基因的丢失可能与血细胞恶变的发生有关。我们用分布在不同染色体上断裂点区域附近的19个微卫星标志，检测29例不同类型白血病微卫星的杂合性丢失，并且利用11号染色体上的几组微卫星对丢失的基因进行定位。

材料和方法

　　1　病例选择　29例白血病患者为1995～1997年北京医科大学第一医院住院就诊患者，其中急性髓细胞白血病(AML)13例，急性淋巴细胞白血病(ALL)6例，慢性髓细胞白血病(CML)6例；慢性淋巴细胞白血病(CLL)3例；毛细胞白血病(HCL)1例。

　　2　DNA标本处理　患者DNA来自未经治疗的骨髓或外周血。骨髓病态细胞数＞30％。每例病例均同时取骨髓和口腔粘膜细胞。口腔粘膜组织作为正常组织DNA对照。骨髓及外周血用酚抽提法或高盐沉淀法提取DNA。口腔粘膜组织DNA的提取采用口腔粘膜消化液经过56℃3小时，100℃10分钟，冰浴5分钟后取上清即可。用紫外分光仪检测所提取DNA浓度。

　　3　PCR引物设计与合成　19对微卫星引物从国际互联网络的基因文库中查得，Research genetics公司合成。实验设计将引物分为两组，第1组12对引物分布于11条不同染色体上12个血液系统肿瘤经常发生染色体断裂的区域，微卫星位点与所在的相应染色体位置情况见附表。第2组引物用于基因定位，选择11号染色体上的8个与几个已知肿瘤基因附近的微卫星^［2］，其中D11S1331位于短臂p15.4 距RBTN1（rhombotin 1）近末端32.2 cR(Centirays，辐射杂交作图用的相对距离); d11S1301在WT1（Wilms tumor）基因近着丝点端28.9 cR，距RBRN2基因17.8 cR。D11S987，D11S1314， D11S916位于q13.3,附近有白血病和淋巴瘤相关bcl1基因（B cell CLL/Lymphoma 1）。距离分别为末端27cR, 着丝点66 cR, 101 cR；位于q23，围绕MLL（Mixed Lineage Leukemia)基因的D11S1356着丝点侧距离MLL7 cR(已经包括在第1组中)，D11S976也为7 cR，D11S924在末端侧45cR。通过检测微卫星的变化，来分析其附近癌相关基因的变化。

　　4　PCR扩增　25μl反应缓冲液中含有模板DNA 0.25ng，Mg^2＋1mmol/L，4×dNTP50μmol/L，引物各10pmol，Taq多聚酶(本实验室合成)0.5U。PCR反应程序：94℃5分钟变性后，93℃30秒，56℃30秒，72℃1分钟，进行30个循环。最后72℃延伸10分钟。4℃保存。实验结果重复2次以上，以排除实验误差。

　　5　聚丙烯酰胺凝胶电泳　按本实验室常规^［3］。

　　6　变性胶电泳　取PCR扩增反应液4～8μl加入1～2倍含95%甲酰胺的溴酚蓝上样缓冲液，在含6mol/L尿素的6％的聚丙烯酰胺凝胶1×TBE，300V进行电泳。

　　7　银染　10％乙醇固定10分钟，双蒸水冲洗2次，1％硝酸浸泡5分钟，双蒸水冲洗2次，加入0.01mol/L硝酸银和0.1%甲醛染色10分钟，双蒸水冲洗数次，8μmol/L硫代硫酸钠和0.05%甲醛显色5～10分钟，至出现清晰条带止。加10％乙酸终止反应。95％乙醇缩胶后置透明玻璃纸中晾干保存。观片灯下阅读结果。

附表　常见白血病染色体易位区域微卫星选择