急性淋巴细胞白血病细胞体外培养

中华血液学杂志 1998年第11期第19卷 方法介绍

作者：魏绪仓　李梅生　邢佩霓　杨娣娣　韩秀蕊

单位：710068　西安，陕西省人民医院血液研究室

　　急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞体外培养比较困难，这主要是因为ALL克隆形成细胞在各种生长因子中的半固体培养基中形成集落的能力有限，目前尚未发现ALL细胞理想培养条件^［1］。有鉴于此，我们开展了ALL细胞体外培养方法的研究，建立了ALL细胞培养体系，对12例ALL细胞进行了体外半固体培养观察，同时对ALL细胞集落形成的因素进行了探讨，现报告如下。

材料和方法

　　1　病例来源　12例ALL患者均经临床血象、骨髓确诊，其中L₁ 7例，L₂ 3例,L₃ 2例。2例曾用VP(长春新碱、泼尼松)方案治疗，但采集细胞前停止治疗至少3周，其余均为初诊未接受过任何治疗的患者。

　　2　细胞制备　抽取患者外周血(WBC＞20.0×10⁹/L)3～5ml或骨髓液1～1.5ml，经肝素抗凝，用Hypaque-Ficoll液分离出单个核细胞，经RPMI 1640洗涤3次后，用IMDM培养液制备成10×10⁶/0.5ml的细胞悬液，按T及B淋巴细胞分离法^［2］，用尼龙棉(200型，USA)去除T细胞，得到ALL细胞悬液，单个核细胞存活率＞95%。用单克隆抗体CD₃、CD₇、CD₁₀标记，要求T淋巴细胞少于3%。

　　3　植物血凝素-单个核细胞条件培养液(PHA-MNCCM)制备　取健康人外周血经肝素抗凝，Hypaque-Ficoll液分离单个核细胞，RPMI 1640洗3次后，用IMDM稀释为1×10⁶/ml的细胞悬液，加入1%PHA-P(1μg/ml细胞悬液)，20%FCS，分装于培养瓶中，置37℃、5%CO₂、饱和湿度的培养箱中，第7天收集并以1?500r/min离心20分钟，上清液置4℃冰箱保存备用。

　　4　丝裂霉素C处理T细胞　通过Hypaque-Ficoll梯度密度离心，从肝素化正常人外周血中分离单个核细胞，用RPMI1640洗3次，调整细胞浓度至10×10⁶/0.5ml，按T及B淋巴细胞分离法^［2］用尼龙棉(200型，USA)获得T细胞，在每毫升T细胞悬液中加丝裂霉素C(Sigma公司)50μg/10⁷细胞，置37℃下培养30分钟，RPMI 1640洗3次除去丝裂霉素C。经丝裂霉素C处理后的细胞停止增殖，但仍保留其辅助功能。

　　5　ALL细胞培养体系　最终浓度为5×10⁵/ml的ALL细胞；最终浓度为3×10⁵/ml的丝裂霉素C处理T细胞；10%PHA-MNCCM；20%FCS；0.8%甲基纤维素；最终浓度为5×10^-5mol/L的2-巯基乙醇及IMDM适量。将上述培养物混匀入培养皿，置37℃、5%CO₂、饱和湿度的培养箱中培养7天，计数两个以上培养皿。

　　6　观察与计数　用倒置显微镜观察细胞生长情况，7天计数，＞25个细胞为集落，＜25个细胞为丛。对单个集落的细胞形态涂片Wright-Giemsa染色镜检，将多个集落收集作细胞化学染色(POX、PAS)以及免疫荧光单克隆抗体(CD₃、CD₇、CD₁₀)检测。为了测定培养体系中某些成分对ALL细胞生长的影响，用上述标准体系做对照，比较ALL细胞生长。

结果

　　1　12例ALL细胞在半固体培养基中均生长，其中10例形成集落。培养24小时后，可见2～4个细胞组成的细胞团，一般第3～4天以细胞丛为主，以后集落逐渐增多、增大，直到第7天，第8天后集落细胞逐渐死亡。第7天计数集落，所产生的集落数量有个体差异。ALL细胞集落计数为(106.0～343.5)个/5×10⁵细胞，平均值(228.5±35.8)个/5×10^５细胞。通常集落较致密，多数含25～100个大小较均一的细胞。取集落涂片Wright-Giemsa染色发现：细胞大小有别，L₃型细胞形态最大，L₂型次之，L₁型细胞最小。细胞分类85%～93%为原始、幼稚型淋巴细胞，形态特点与培养前患者白血病细胞基本相同，组织化学染色POX(-)、PAS(-～+)、AKP(-)，免疫学检查：混合收集的集落用CD₃、CD₇、CD₁₀标记，与培养前膜标记一致。因此可以证实集落为ALL细胞集落。2例未形成集落，第7天观察主要为单、双细胞，第7天细胞计数分别为1.4×10⁶/ml、2.2×10⁶/ml，均较前增多。取细胞涂片作形态、组化、免疫分析，证明是ALL细胞。2集落的数量与植入ALL细胞数量在一定范围内呈线性关系。在该范围内植入细胞数量越多，集落的数量亦增多，但过多细胞会尽快耗尽培养基营养物质而导致集落提前崩解，一般植入细胞以不超过5×10⁵/ml为宜。

　　ALL细胞集落形成需要经丝裂霉素C处理的异体T细胞，缺乏此细胞仅有少数集落存在，集落产率与加入滋养T细胞浓度在一定范围内成正比，实验证明以3×10⁵/ml最好。

　　PHA-MNCCM和2-巯基乙醇对ALL细胞集落形成有促进作用。在部分实验中加入PHA-MNCCM，集落数为213±20，不加PHA-MNCCM组，集落数为137±13，两者相比有显著差异(P＜0.05)，PHA-MNCCM最佳浓度为10%。加入2-巯基乙醇可增加集落数量，但实验证明加与不加其集落数之间比较，无显著性差异(P＞0.05)。

讨论

　　ALL是淋巴细胞异常克隆性增殖疾患，这种克隆形成细胞在体外常规细胞培养中常失去增殖能力。因此选择ALL细胞在体外的理想培养条件是深入研究白血病细胞生物学特性及发病机制的关键。由于ALL细胞体外生长所需的条件较复杂，且难以掌握^［3，4］，国内有关ALL细胞培养体系的报道甚少，国外亦有成功的报告^［5～7］，但由于使用方法不同，致使ALL细胞产率不尽一致，对ALL细胞最适培养条件仍在继续探讨。

　　我们在参考国外学者方法基础上，建立了ALL细胞体外培养体系，并经过对12例ALL患者白血病细胞体外培养观察，证实该法较简捷、结果稳定、集落产率高。

　　本研究ALL细胞培养结果均经倒置显微镜下观察，细胞化学染色，形态学、免疫学分析证实为ALL细胞形成。我们进一步观察到，在ALL细胞形成集落过程中，以下三种因素显著影响到培养结果：①ALL细胞植入量影响集落产率；②在培养物中要适量加入经丝裂霉素C处理的异体正常T细胞；③在培养基中加入PHA-MNCCM有利于集落生长。

　　ALL细胞在体外半固体培养基中有两种生长类型：一种为集落型，另一种为以单或双细胞存在的无集落型，临床随访，前一种疗效较好。本组10例集落形成患者，经化疗后均完全缓解，另2例不形成集落患者经化疗后1例未缓解，1例部分缓解，因此，ALL细胞形成集落能力与临床疗效有一定关系。但能否以此预示白血病化疗效果，有待进一步探讨。

　　ALL细胞体外培养成功，对ALL细胞生长、增殖、分化及调节等生物学特性的研究有重要意义，为临床诊断、预后判断以及药物筛选等提供理论依据和实验手段。

参 考 文 献

　　1　陈赛娟，陈国强，陈竺.急性白血病和造血生长因子及其受体.实验血液学杂志，1995，3：131-136.

　　2　邓家栋，杨崇礼，杨天楹，主编.血液病实验诊断.第1版.天津：天津科学技术出版社，1985.392-393.

　　3　Estrov Z,Freedman MH.Growth requirements for human acute lymphoblastic leukemic cells:refinement of a clonogenic assay.Cancer Res,1988,48:5901-5907.

　　4　Champlin R,Gale RP.Acute lymphoblastic leukemia:recent advances in biology and therapy.Blood,1989,73:2051-2066.

　　5　Izaguirre CA,Cuarti J,Messner H,et al.A colony assay for blast cell progenitors in non-B,non-T(common) ALL.Blood,1981,57:823-829.

　　6　Dunn J,Dickinson A,Proctor SJ.A simple colony assay for the growth of acute lymphoblastic leukaemia cells in vitro.Hematol Rev,1989,3:23-28.

　　7　Touw I,Delwel R,Bolhuis R,et al.Common and pre B ALL cells express interleukin-2 receptors and interleukin-2 stimulatesin vitro colony formation.Blood,1985,66:556-561.

(收稿：1996-09-02　　修回：1998-01-19)

(校对：董文革)