TPA对人白血病传代细胞系中IL-1β mRNA表达的影响

中华血液学杂志 1998年第11期第19卷 研究报告

作者：鲍永利　徐蔼复　杨贵贞　于永利

单位：130021　长春，白求恩医科大学基础免疫学教研室(鲍永利、杨贵贞、于永利)；吉林省人民医院血液科(徐蔼复)

　　白细胞介素(IL)-1β不仅对免疫系统,而且对造血、神经、内分泌等多个系统发挥多种生物学效应^［1］，是一个在机体防御方面起中心作用的细胞因子。IL-1β的异常表达往往与某些疾病密切相关，尤其在白血病的发生、发展中起着重要的作用。我们研究了乙酰豆寇佛波酯(TPA)对人单核细胞白血病传代细胞系U937细胞、人红白血病传代细胞系K562细胞、人T淋巴细胞白血病传代细胞系MT-2细胞中IL-1β mRNA表达的影响，从而探讨IL-1β与白血病细胞分化的相关性。

材料和方法

　　1　材料　TPA为Sigma公司产品;U937、MT-2、K562细胞株由本实验室传代培养；随机引物标记试剂盒购自Promega公司；α³²P-dCTP购自福瑞公司；IL-1β PGEM4Z质粒为本实验室构建。

　　2　细胞培养　将U937、MT-2、K562细胞用含10%小牛血清的IMDM培养液传代培养，待生长良好时用无血清IMDM培养，并分组刺激。

　　3　Northern blot

　　3.1　细胞总RNA的提取及转膜：收集经过刺激培养的细胞，用PBS洗涤后用异硫酸胍法提取细胞总RNA，然后进行甲醛变性电泳，电泳后转膜，将膜于80℃烤2小时，密封于塑料袋中于-20℃保存。

　　3.2　探针的标记：IL-1β PGEM4Z重组质粒为本室自制，方法见文献［2］。将其用HindⅢ和EcoRⅠ双酶切，得到IL-1β cDNA片段，片段大小为388bp；γ-actin片段的获得是用γ-actin引物(上游端引物为5′-GATGGCCAGGTCATCACCATTGGC-3′，下游端引物为5′-GAAGGTGGACAGTGAGGCCAGGAT-3′)PCR扩增U937细胞总cDNA，得到γ-actin片段大小为327bp，将上述两个片段分别用随机引物法标记上α³²P-dCTP^［3］。

　　3.3　杂交、洗膜及放射自显影：将膜放入杂交袋中，加入30ml预杂交液(6×SSC ，0.25%脱脂奶粉，0.1%SDS,20mmol/L焦磷酸钠）。60℃摇动水浴2小时。预杂交后加入IL-1β cDNA探针，60℃摇动水浴18小时。杂交后将膜取出，置于65℃的2×SSC，0.1%SDS中洗膜，洗4次，每次30分钟,洗后将膜晾干，于暗室压X线片，-30℃曝光48小时后，冲洗X线片。将同一张膜上的探针于95℃洗脱后，再与γ-肌动蛋白cDNA探针以同样的方法进行杂交。

结　　果

　　1　TPA刺激U937细胞中IL-1β mRNA表达的时间效应　将U937细胞分别用TPA刺激3，6，9，12小时，提取总RNA，转膜，行Northern blot杂交，结果显示刺激12小时表达量较高，9小时表达量次之，6小时表达量更少，3小时几乎无表达，未用TPA刺激的对照组不表达IL-1β mRNA。

　　2　TPA诱导U937、K562、MT-2细胞中IL-1β mRNA的表达　将U937、MT-2、K562分别分为无刺激的对照组及TPA刺激组(200U/ml)，每组1×10⁸个细胞，培养12小时后，提取总RNA,并进行Northern blot杂交，结果如附图所示，U937细胞，MT-2细胞，K562细胞在无刺激时均无IL-1β　mRNA的表达，用TPA刺激后IL-1β的表达量明显增加。

　　1：U937细胞mRNA(无TPA刺激)；

　　2：TPA(200ng/ml)刺激后U937细胞mRNA；

　　3：MT-2细胞mRNA(无TPA刺激)；

　　4：TPA(200ng/ml)刺激后MT-2细胞mRNA；

　　5：K562细胞mRNA(无TPA刺激)；

　　6：TPA(200ng/ml)刺激后K562细胞mRNA

　　附图　TPA刺激后U937细胞、MT-2细胞及K562细胞中

　　IL-1β mRNA的表达

讨 论

　　IL-1是大家比较熟知的细胞因子，其包括IL-1α和 IL-1β两种，在人体主要以表达IL-1β为主。IL-1不仅对免疫系统而且对神经、内分泌等多个系统都起着极其重要的作用，IL-1的异常表达与许多疾病都是密切相关的，如再生障碍性贫血常伴有IL-1的异常低表达；急性、慢性白血病细胞本身可分泌IL-1，此IL-1可刺激这两种细胞产生一些生长因子，这些因子又促进这两种细胞的增殖。如果用IL-1ra阻断IL-1活性，则白血病细胞的增殖受到抑制^［4］。

　　TPA作为一个诱变剂，它可使人单核细胞白血病传代细胞进一步分化成熟。我们发现在TPA刺激的人单核细胞白血病传代细胞系U937细胞中IL-1β mRNA的转录明显增强，而且动态观察结果表明IL-1β在刺激后即开始上升，12小时达高峰，另外，TPA还可不同程度地诱导人红白血病传代细胞系K562细胞及人T淋巴细胞白血病传代细胞系MT-2细胞的IL-1β mRNA的表达，此结果说明，在TPA诱导白血病细胞分化的过程中IL-1β可能起着一定的作用。

参 考 文 献

　　1　白川文彦，齐藤和义，安部美穗子，他. IL-1遗传子の转写调节机构. 临床免疫，1993，25:930-936.

　　2　鲍永利，杨贵贞，于永利. 人IL-1β PCR-cDNA片段的克隆及鉴定. 中国免疫学杂志，1994，10:209.

　　3　萨姆布鲁克 J，弗里齐 EF，曼尼阿蒂斯 T，著. 金冬雁，黎孟枫译. 分子克隆，1992,10:502-504.

　　4　Estrv Z. Suppression of chronic myelogeneous leukemia colony growth by interleukin-1(IL-1) receptor antago-nist solube IL-1 receptor: a novel application for inhibitors of IL-1 activity. Blood, 1991, 78:1476-1480.

(收稿：1997-06-27　　修回：1997-12-04)

(校对：张吉贤)