耐药人白血病细胞GSH含量、GST活力及其同工酶、MRP表达的研究
中华血液学杂志 1998年第5期第19卷 论 著
作者：夏瑞祥 林果为 励雁峰 钱耕荪
关键词： 白血病细胞株；多药耐药相关蛋白；谷胱甘肽；谷胱甘肽S转移酶
摘要 目的：了解多药耐药基因（mdr1）机制以外导致人白血病细胞耐药的因素。方法：采用生化方法，对K562和HL-60敏感和耐药细胞株谷胱甘肽（GSH）含量、谷胱甘肽S转移酶（GST）活力进行测定；用Northern杂交对GSTα、π、μ和多药耐药相关蛋白（MRP）mRNA表达进行检测；用Western杂交对GSTα、π、μ蛋白表达进行检测。结果：与敏感株相比，K562/H20和K562/VCR的GSH含量、GST活力明显增高，HL-60/Adr的GSH含量和GST活力无明显增高，Northern和Western 杂交可见GSTα、π和GSTπ、μ在K562/H20和K562/VCR过度表达，HL-60/Adr无GST 同工酶过度表达，MRP在三种耐药株均有过度表达。结论：GSH、GST和MRP参与了K562/H20和K562/VCR耐药，HL-60/Adr耐药与GSH、GST无关，与MRP有关。在实际应用中，应对多种耐药指标同时进行检测。
A study of the GSH contents, GST activity and the expression of GST isoenzyme and MRP in drug-resistant leukemic cell lines Xia Ruixiang, lin Guowei, Li Yanfeng, et al.Department of Hematology, Huashan Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai 200040
Abstract Objective:To understand the non-mdr1 mechanism in multidrug-resistant leukemic cell lines.Methods:GSH contents and GST activity were measured by biochemical methods, the expression of GST isoenzyme α、π、μ and MRP mRNAs were examined by Northern blot, and the expression of GST α、π、μ proteins were examined by Western blot in sensitive HL-60, K562 and resistant k562/H20,HL-60/Adr,K562/VCR leukemic cell lines,respectively.Results: compared with K562/S,GSH contents and GST activities were increased in K562/H20 and K562/VCR,and GST α、π or GST μ、π were overexpressed in K562/H20 or K562/VCR， while there was no difference of GSH contents, GST activities or GST isoenzyme expressions between HL-60/Adr and HL-60/S. The increased expressions of MRP mRNA were revealed in the three resistant cell lines.Conclusion:GSH,GST and MRP involved in the drug resistance of K562/H20 and K562/VCR, while only MRP associated with drug resistance of HL-60/Adr.
Key words Leukemic cell line Multidrug resistance associated protein Glutathione Glutathione s transferase
肿瘤细胞对化疗药物的耐药性，是化疗最终失败的主要原因。研究表明，除多药耐药基因mdr1外，尚有多种机制与耐药有关，对于这些机制的研究，有助于更进一步了解包括白血病在内的肿瘤细胞耐药机制，为治疗中克服耐药，提高疗效提供有益帮助。为此，我们对表达
本课题受国家自然科学基金(39470320)资助
作者单位：200040 上海医科大学华山医院血液科［夏瑞祥(研究生，现在安徽医科大学附属第一医院血液科)、林果为］；上海市肿瘤研究所(励雁峰、钱耕荪)
mdr1的白血病耐药细胞株K562/H20和 K562/VCR以及不表达mdr1的白血病耐药细胞株 hL-60/Adr进行谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽 S 转移酶（GST）及其同工酶、多药耐药相关蛋白（MRP）等方面的检测。
材料和方法
1 K562和HL-60细胞株由中国科学院上海细胞学研究所提供，以RPMI1640培养液（含15%灭活小牛血清），在37℃、5%CO2培养箱中，培养2～3天传代1次。 K562/H20、K562/VCR和HL-60/Adr分别为由高三尖杉酯碱（HHT）、长春新碱（VCR）诱导K562和阿霉素（Adr）诱导HL-60所建立的多药耐药（MDR)细胞株，由中国医学科学院血液学研究所提供，分别在含HT0.2mg/L、VCR 1mg/L和Adr 1μmol/L 的培养液中稳定生长。
2 探针与抗体 MRP cDNA 探针由 Dr Zamen (The netherlands Cancer Institute)惠赠，GSTα、π、μ cDNA探针由Dr Pickett ( merck Frost Center for Therapeuty Research, Canada) 惠赠，GSTα、π、μ抗体由Dr primiano (John Hopkins University)惠赠。
3 GSH含量测定 参照文献［1］。
4 GST 活力测定 参照文献［2］。
5 细胞总RNA的提取 按异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法，测260nm处A(吸光度，曾称光密度OD)值、RNA定量，A260/A280＞2。常规蛋白质提取，测样品A595值，对照标准蛋白浓度——A595值，可推出样品蛋白浓度。
6 Northern 杂交 随机引物法，32P-dATP标记，每份样品取总RNA 15μg, 电泳、转膜、杂交、显影。
7 Western 杂交 以10μg蛋白质样品电泳、转膜及杂交，DAB显色。
8 统计学处理采用t检验。
结果
1 GSH、GST在耐药株中的变化 由附表可见，与敏感株相比，K562/H20和K562/VCR的GSH含量与GST活力均明显增高。Northern杂交及Western杂交均显示GSTα、π及GSTπ、μ在K562/H20及K562/VCR呈过度表达，未见HL-60/Adr GST α、π、μ等同工酶表达增强。图1示K562/H20和K562/VCR gSTπ mRNA表达。
附表 敏感和耐药白血病细胞株GSH含量
(mmol/L 107细胞)和GST活力(
±s)
| 细胞株 |
GSH含量
(mmol/L) |
GST活力
(nmol*min－1／mg蛋白) |
| K562 |
1.35±0.19 |
17.02±0.79 |
| K562/VCR |
1.89±0.08＃ |
26.50±0.53＃ |
| K562/H20 |
1.65±0.13 |
24.09±0.98＃ |
| HL-60 |
4.44±0.28 |
22.37±1.19 |
| HL-60/Adr |
4.50±0.21△ |
22.93±1.17△ |
GSH系5次实验结果；GST系3次实验结果与敏感株相比，*P＜0.05,#P＜0.001,△P＞0.05
1：K562；2：HL-60;3:HL-60/Adr;4:K562/H20;5:K562/VCR
图1 Northern杂交示白血病细胞株GSTπ同工酶
mRNA的表达
2 MRP在耐药株中的表达 由图2可见，Northern杂交示MRP mRNA在K562/H20、K562 / VCR及HL-60/Adr均呈过度表达。
1：K562/VCR；2：K562/H20；3：HL-60;4:HL-60/Adr;5:K562
图2 Northern杂交示K562/H20、K562/VCR、
HL-60/Adr MRP mRNA表达
讨论
GSH是一种含半胱氨酸的三肽，为细胞内主要的非蛋白巯基，GST可催化包括化疗药物在内的多种底物与GSH形成巯基结合物，进一步代谢而使药物失活，从而造成肿瘤细胞的耐药性。我们对K562/H20和K562/VCR检测的结果与文献报道的多种肿瘤细胞耐药株结果一致［3］，均示GSH含量和GST活力增高,说明这种增高与它们耐药性的增高有关。由于GST有多种同工酶，在不同的耐药株同工酶的表达可不相同，甚至在GST活力不高的K562/Adr细胞株。有人报道在耐药株中可检出GSTα高表达［4］，结合本研究结果，我们认为对耐药的检测应包括对GST活力和GST同工酶的检测，才能较全面地反映GSH、GST系统在耐药中的变化。我们对 hL-60和HL-60/Adr检测的结果说明GSH和GST不参与其耐药机制。
MRP基因最初是在不表达mdr1的人小细胞肺癌耐药株中克隆出来的，分子量为19万,与p170同属ATP结合盒(ATP-binding cassette)超家族成员，可将药物从胞浆内泵出细胞外，进一步研究提示，MRP在耐药中的作用是多方面的［5］。HL-60/Adr为非mdr1型MDR株，我们的结果与文献报道一致，MRP呈过度表达，表明MRP 在HL-60/Adr 耐药中的重要地位。K562/H20和K562/VCR表达mdr1［6］,但MRP的表达尚不清楚。本实验证实，在K562/H20和K562/VCR也见MRP的过度表达，说明MRP参与了它们的耐药机制。
结合文献和我们对K562/H20、 K562/VCR和HL-60/Adr检测的结果，认为在实际应用时，除了对mdr1检测外，尚应对其它多种耐药指标进行检测，这样更能反映耐药的真实情况，为临床有效地应用药物，克服耐药性及提高疗效提供理论依据。
参 考 文 献
1 Ellman GL. Tissue sulfhydryl groups. Arch Biochem Biophys,1959,82: 70-77.
2 Habig WH, Pabst MT, Jaloby WB． Glutathione S-transferases.J Biol Chem，1974， 249: 7130-7139.
3 Ahn H, Lee K, Kim K, et al. Effect of glutathione and its related enzymes on chemosensitivity of renal cell carcinoma and bladder carcinoma cell lines. J urol， 1994，151:263-267.
4 Kato S, Ideguchi H, Muta K, et al. Mechanisms involved in the development of adriamycin resistance in human leukemia cells. Leuk Res，1990，14:567-573.
5 Almquist KC, Loe DW, Hipfner DR, et al. Characterization of the Mr190000 multidrug resistance-associated protein(MRP) in drug selected and transferred human tumor cells. Cancer Res，1995，55:102-109.
6 钱其军，韩俊领，严文伟，等. K562/H20和K562/Mel细胞株对高三尖杉酯碱与马法兰耐药机制的比较研究.中华血液学杂志，1996，17:354-357.
(收稿：1997-11-03 修回：1998-01-04)
(校对：张吉贤)
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