胃液对膀胱癌细胞系细胞凋亡的影响

中华实验外科杂志 1999年第3期第16卷 简报

作者：田斌群　胡礼泉　郑新民　姚学军　李世文　王家治　张国辉

单位：田斌群　胡礼泉　郑新民　李世文　王家治　张国辉　430071　武汉，湖北医科大学附属第二医院泌尿外科；姚学军　病毒研究所

　　关于胃代膀胱术对膀胱肿瘤复发的影响，国内外报道不多。我们跟踪随访胃代膀胱术患者近20年，发现胃代膀胱术后膀胱肿瘤的复发呈逐渐减少的趋势，复发后肿瘤的病理学级别降低、癌巢萎缩。为了探讨胃代膀胱术抑制膀胱肿瘤复发的机制，我们用胃液模拟胃代膀胱的环境，观察了胃液对膀胱移行细胞癌细胞系BIU-87细胞凋亡的影响，报道如下。

　　一、材料与方法

　　将BIU-87细胞系置于37 ℃体积分数为5%CO₂、体积分数为10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养，实验各组分别加胃液(终浓度7.6 mmol/L)、稀盐酸(终浓度7.6 mmol/L)、阿霉素(终浓度2 mg/L)和无药培养液，培养24小时后收取细胞进行检测。①凋亡指数(AI)测定：取出细胞玻片，PBS洗3次，中性缓冲福马林固定30分钟,常规HE染色，光镜观察。每组观察3张片，每片观察5个视野，记录100个细胞中的凋亡细胞数，分析1500个细胞的观察结果，计算AI值。②DNA提取和电泳：培养瓶中细胞经胰酶消化脱落后，加入细胞裂解液，56 ℃水浴过夜，加等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提，4 ℃离心取上清，加NaAc和无水乙醇，4 ℃离心沉淀DNA，弃上清，加TE，37 ℃水浴溶解2小时,上样于2%琼脂糖凝胶中，电压4 V/cm,电泳4小时，观察结果。③流式细胞仪分析：培养瓶中细胞经胰酶消化脱落后，缓慢加入75%冷乙醇固定，冰箱过夜。加入PI染液，避光染色30分钟，流式细胞仪检测。

　　二、结果

　　1. 形态学观察及AI值测定：细胞经胃液、稀盐酸、阿霉素处理24小时,HE染色显示部分细胞固缩，胞浆嗜碱，核染色质浓缩至核膜下成新月状，呈现典型的凋亡改变。AI值测定，胃液组为9.6%，稀盐酸组为8.9%，阿霉素组为37.8%，无药培养液组为6.4%。统计学分析显示胃液组与阿霉素组、无药培养液组之间具有高度差异显著性(P＜0.01)，但与稀盐酸组比较差异无显著性(P＞0.05)。

　　2. DNA电泳：胃液组、稀盐酸组及阿霉素组均出现了比较典型的DNA梯状带谱，阿霉素组的梯状带谱最大，胃液组及稀盐酸组的梯状带谱相似，无药培养液组的梯状带谱不明显。

　　3. 流式细胞仪分析：实验各组均出现了亚二倍体峰，又称细胞凋亡峰，阿霉素组、胃液组、稀盐酸组及无药培养液组的凋亡细胞比率分别为42.74%、8.09%、7.26%和6.71%，统计学分析显示胃液组与阿霉素组、无药培养液组之间差异具有高度显著性(P＜0.01)，但与稀盐酸组比较差异无显著性(P＞0.05)。

　　三、讨论

　　细胞凋亡是一种不同于坏死的细胞死亡形式。坏死由外界有害因素触发，表现为细胞膜通透性增加，细胞外形发生不规则变化，内质网扩张，线粒体肿胀，溶酶体破坏，细胞膜破裂，胞浆外溢，细胞碎片被巨噬细胞吞噬。细胞凋亡则是由基因调控的一种程序性死亡过程，细胞内核酸内切酶激活，在核小体间切割DNA链，使DNA降解为以核小体(180～200 bp)为单位的片断。形态特征表现为细胞首先收缩变圆，与邻近细胞脱离，失去微绒毛，细胞膜表现起泡，胞浆浓缩，核染色质凝聚于核膜周边，继之，核仁裂解，细胞膜内陷包裹核碎片形成凋亡小体。DNA电泳显示DNA呈梯状带型。流式细胞仪分析显示G1峰前面出现亚二倍体峰。我们应用普通显微镜，结合DNA电泳及流式细胞仪分析技术，均观察到了胃液诱导膀胱移行细胞癌细胞系细胞凋亡的典型表现。

　　细胞凋亡与肿瘤的关系非常密切。肿瘤的形成，过去一直认为是细胞不断增殖的结果，近年来人们认识到细胞不能及时死亡也是肿瘤形成的原因之一^［1］。目前很多抗癌药都是通过诱导细胞凋亡来杀灭肿瘤细胞的。阿霉素是一种常用的干扰mRNA转录的抗癌药，有报道阿霉素能诱导Hela S3细胞株发生凋亡^［2］。我们以阿霉素作为阳性对照，稀盐酸作为参考对照，发现阿霉素能显著诱导膀胱移行细胞癌细胞系发生凋亡，胃液和稀盐酸也有相似作用，但程度较轻。本实验中胃液和稀盐酸的终浓度相同，诱导细胞凋亡的程度相近，统计分析显示二者之间差异无显著性，说明胃液诱导细胞凋亡的机理可能与稀盐酸相同，都是通过改变细胞培养液的pH值而实现的。目前国内外尚没有胃液与细胞凋亡关系的报道。我们的研究证实了胃液能诱导膀胱移行细胞癌细胞系的凋亡，从而为临床开展胃代膀胱术治疗膀胱肿瘤提供了一定的参考依据。

　　本课题为湖北省教委资助项目(No.G91-12)

　　参考文献

　　1　Thompson CB. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease. Science, 1995,267:1456-1457.

　　2　Skladanowski A, Konopa J. Adriamycin and daunomycin induce programmed cell death (apoptosis) in tumour cells. Biochem Pharmacol, 1993,46:375-376.

(收稿：1998-11-14　修回：1999-02-05)