前列腺素E₂对膀胱癌患者LAK细胞增殖及抗肿瘤细胞毒作用的影响

中华实验外科杂志 1999年第1期第16卷 膀光肿瘤

作者：史葆光　王志平　陈一戎　秦大山　陈雪红　王亦秋

单位：730030　兰州医学院第二附属医院泌尿外科研究所(史葆光、王志平、陈一戎、秦大山)；同位素室(陈雪红、王亦秋)

　　关键词： LAK细胞；膀胱癌；前列腺素E₂；增殖；细胞毒；放免测定

　　 　　【摘要】　目的　探讨前列腺素E₂(PGE₂)在膀胱癌患者淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)增殖及细胞毒的作用。方法　LAK细胞培养于含不同浓度的PGE₂的培养基中，并用细胞计数法测定其细胞增殖率，以BIU87、EJ及患者自体肿瘤细胞为靶细胞，用MTT法测定LAK细胞对膀胱癌细胞的细胞毒作用。结果　0.05～5μg/L PGE₂对LAK细胞的增殖呈浓度依赖性抑制。PGE₂ LAK细胞对膀胱癌细胞的杀伤则影响不明显。膀胱癌细胞系BIU87的条件培养基的PGE₂含量明显高于PBMC的条件培养基。结论　膀胱癌患者由IL-2诱导的LAK增殖可被由PBMC和膀胱癌细胞产生的PGE₂所抑制。

　　 In vitro effects of prostaglandin E₂ on the proliferation of lymphokine activated killer cells and their cytotoxicity against bladder tumor cells in patients with bladder cancer Shi Baoguang, Wang Zhiping, Chen Yirong, et al. Institute of Urological Surgery, Second Affiliated Hospital, Lanzhou Medical College, Lanzhou 730030

　　【Abstract】 Objective To investigate the combined effects of interleukin-2 (IL-2) with prostaglandin E₂ (PGE₂) on the proliferation and cytolysis of bladder tumor cells by lymphokine activated killer(LAK) cells in patients with bladder cancer.Method LAK cell proliferation was assayed in the presence of various concentrations of PGE₂ by cell counting. Bladder cancer cell lines BIU-87, EJ and bladder tumor cells from the patients were cultured as target cells, and cytotoxicity of LAK cells were determined by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay. Result The proliferation of LAK cells induced by IL-2 was inhibited by PGE₂ (0.05 to 5 ng/ml) in a dose dependent manner. The level of PGE₂ in conditioned media from BIU-87 was significantly higher than that in the conditioned media from PBMC.Conclusion LAK cell proliferation induced by IL-2 in patients with bladder cancer is inhibited by PGE₂ produced by PBMC and bladder cancer cells.

　　【Key words】 Lymphokine activated killer cells Bladder cancer Proliferation Cytotoxicity Prostaglandin E₂

　　我们通过本研究探讨白细胞介素Ⅱ(IL-2)与PGE2联合应用在膀胱癌患者LAK增殖及细胞毒杀伤中的作用，现将结果报道如下。

　　材料与方法

　　1. 主要试剂　PGE₂由重庆第三制药厂提供，RPMI 1640培养基为美国GIBCO公司产品，噻唑蓝(MTT)、胶原酶IV、透明质酸酶V和DNA酶Ⅰ及L-谷胺酰氨均产于Sigma公司，重组白细胞介素Ⅱ(IL-2)由长春生物所购进。胎牛血清(FCS)、胰岛素和地塞米松从华美公司购进。

　　2. 病人与LAK细胞分离培养　从1995年3月至1996年7月选择21例病理诊断的膀胱移行细胞癌患者，在患者接受治疗及手术前采取血标本，用20名健康人作对照。采集病理诊断的19例膀胱移行上皮癌患者外周血5ml，用淋巴细胞分离液梯度离心法离心(2000rpm，30分钟)分离单个核细胞(PBMC)，PBMC(10⁹细胞/L)混悬于全培养基(CM)内(RPMI 1640中含青链霉素各100U/ml、庆大霉素50U/ml、2mmol/L-谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸钠和15%FCS)在37℃和5%CO₂条件下培养于25cm²细胞培养瓶中2小时，未贴壁细胞(10⁶细胞/ml)移入另一培养瓶中、加入IL-2(1000U/ml)培养96小时。

　　3. LAK细胞增殖实验　300μl未贴壁细胞(15000细胞/孔、CM中内含IL-2 1000U/ml)培养于96孔细胞培养板中并加入不同浓度的PGE₂(0～5μg/L)，每一浓度含6孔，共重复5次，每24小时在血球计数板进行细胞计数。人类膀胱癌细胞系BIU-87和EJ由北京医科大学泌尿外科研究所提供。膀胱癌组织中癌细胞的分离用Kariya方法^［1］。

　　4. 细胞毒实验　LAK细胞的细胞由MTT法测定^［2］，BIU87或EJ细胞培养于96孔培养板24小时后作为靶细胞，吸除各孔培养基后，分别于各实验孔中加入预先已用PGE₂(0.5μg/L)处理48小时的LAK细胞悬液，使效/靶比例达到30∶1，每一浓度含4孔，共重复4次，37℃下孵育4小时后吸除培养基，各孔用含0.2%FCS的RPMI 1640洗，再向每孔加入100μl含0.5%MTT的RPMI 1640 (0.5%FCS)于37℃下孵育2小时后再吸净培养基，每孔加入100μl DMSO，震荡、溶解后，以DMSO作空白，用酶标仪(南京电子仪器厂)测定每孔在570nm的吸光度。

　　LAK对非贴壁的膀胱癌细胞BTC的杀伤采用相似的方法测定。

　　5. 条件培养基的制备　长满90%底面的BIU-87细胞或200000/ml PBMC在25cm²培养瓶中培养于无血清培养基(SFM，RPMI 1640培养基中含青链霉素各100U/ml、庆大霉素50U/ml、2mmol/L-谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸钠、0.5g/L胰岛素和1μmol/L地塞米松，更换细胞培养基、细胞在10ml SFM中继续培养48小时，收集条件培养基，离心(40g)10分钟，用0.22μm滤膜过滤，存于-20℃备用。共收集21例膀胱癌患者和19例健康人PBMC的条件培养基。PGE₂(21例膀胱癌患者及20例健康人血浆、PBMC或BIU87细胞条件培养基)的含量用放免法测定，PGE₂诊断药盒由苏州医学院血栓室提供，方法按试剂盒说明进行。

　　6. 统计学处理　方差分析，t检验，u检验。

　　结　果

　　1. PGE₂对LAK细胞的增殖的影响(图1，图2)　梯度浓度的PGE₂(0～5μg/L)作用于LAK细胞96小时，PGE₂呈浓度依赖性明显抑制LAK细胞的增殖(P＜0.01)。从培养24小时开始LAK细胞的增殖可明显地被0.05～5μg/L PGE₂所抑制。

　　图1　PGE₂浓度与LAK细胞增殖的关系

　　图2　PGE₂对膀胱癌患者LAK细胞增殖的影响

　　2.PGE₂对LAK细胞的细胞毒作用的影响　膀胱癌患者的LAK细胞用IL-2加0.5μg/L PGE₂处理对杀伤肿瘤的细胞毒作用影响不明显(P＞0.05)。

　　3. 条件培养基及膀胱癌患者血浆PGE₂　膀胱癌细胞BIU87的条件培养基中PGE₂含量(0.75±0.11ng/L)明显高于PBMC的条件培养基(0.48±0.10ng/L)。用SFM作为对照，然而膀胱癌患者血浆PGE₂水平与健康人无明显差异。讨　论

　　本研究结果发现PGE₂呈浓度依赖性抑制LAK细胞增殖。PGE₂能抑制T细胞的增殖及有丝分裂^［3］。肿瘤细胞或免疫细胞产生PGE₂的增加是加速肿瘤逃避机体免疫监视的重要机制^［3］。PGE₂作为抑制信号可抑制免疫细胞增殖、有丝分裂、淋巴因子产生、抗体依赖性细胞毒作用、细胞介导的细胞溶解等免疫功能。PGE₂对LAK细胞的增殖及细胞毒作用可能通过多种途径，免疫细胞存在PGE₂受体。细胞的cAMP的降低可能与LAK细胞的抑制有关^［4］。此外PGE对淋巴细胞的作用可能还通过其它途径，这些途径包括：抑制激活细胞的组织相容抗原和IL-2受体的表达。Constantin^［3］的资料表明PGE₂可抑制培养的PBMC产生IL-2，PGE₂对乳腺癌患者LAK细胞活性抑制时伴有CD56细胞的IL-2受体表达降低。

　　本课题为甘肃省自然科学基金资助项目(No.ZQ-96-12)

　　 参考文献

　　1　Girotti A W. Mechanisms of photosensitization. Photochem. Photobiol， 1983, 38:745-751.

　　2　Hussain R F, Nouri A M E, Oliver R T D A. New approach for measurement of cytotoxicity using colorimetric assay J Immunol. Methods, 1993, 160:89-96.

　　3 Okada F, Hosokawa M, Hasegawa J, et al. Enhancement of in vitro prostagladin E₂ production by mouse fibrosarcoma cells after co-cultured with various anti-tumour effector cells. Br J Cancer, 1994, 70:233-238.

　　4 Ben-Efaim S, Tak C, Fieren M J W A. Activity of human peritoneal macrophages against a human tumor:Role of tumor necrosis factor-α PGE₂ and nitrte, in vitro studies. lmmunol Lett, 1993,37:27-33

(收稿：1998-08-31　修回：1998-10-30)