原发性支气管肺癌MRI相对信号强度与PCNA相关性的研究

临床放射学杂志 2000年第7期第19卷 胸部放射学

作者：许冬明　顾伟中　叶强

单位：许冬明(200072 上海同济大学医学院附属铁路医院放射科)；顾伟中(200072 上海同济大学医学院附属铁路医院放射科)；叶强(200072 上海同济大学医学院附属铁路医院放射科)

　　关键词： 肺癌；MRI；信号强度；增殖细胞核抗原；免疫组化

　　【摘要】　目的　探讨肺癌组织的MRI相对信号强度与增殖细胞核抗原(PCNA)之间的关系。　材料与方法　26例肺癌患者，术前用Resonex 0.38T磁共振成像系统，行横断面SE T₁WI，GR序列成像，增强后行SE T₁WI。术后标本采用ABC免疫组化技术，观察PCNA在26例肺癌中的表达。　结果　Gd-DTPA增强后增殖活性较低的肿瘤细胞(5%＜PCNA≤50%)，其MRI相对信号强度增加值明显大于增殖活性较高的肿瘤细胞(PCNA＞50%)的增加值(P＜0.05)。肺癌病灶的MRI形态学特征与PCNA间无相关性。　结论　肿瘤细胞吸收Gd-DTPA的多少与其增殖活性的高低有关，因此MRI信号强度在一定程度上可反映肿瘤细胞的增殖情况，从而间接地反映肿瘤细胞的生物学行为。

The Relationship between MRI Relative Signal Intensity and the Expression of PCNA in Lung Carcinoma

XU Dongming, GU Weizhong, YE Qiang. Department of Radiology, The Affiliated Railway Hospital, Medical College of Shanghai Tongji University, Shanghai 200072, P.R.China

　　【Abstract】　Objective　To investigate the relationship of MRI relative signal intensity and the expression of PCNA in lung carcinoma.　Materials and Methods　SE T₁WI, gradient echo and Gd-DTPA enhanced SE T₁WI scanning were performed in 26 cases of pathologically proved lung cancer with a 0.38T MR unit. The expression of PCNA was measured by using ABC immunohistochemical methods.　Results　The expression of PCNA was significantly related to the increase of MRI relative signal intensity (SI_rel) (P＜0.05). MRI morphological characters of lung cancer bore no relationship to PCNA.　Conclusion　The increase of MRI relative signal intensity (SI_rel) provides a useful quantitative indicator to predict the cell proliferation (PCNA) with a certain degree, and, therefore, indirectly reflects the degree of malignancy of the biological behavior of lung cancer.

　　【Key words】　Lung cancer 　MRI 　Signal intensity 　PCNA 　Immunohistochemistry

　　肿瘤恶性程度的判断，以及对治疗效果和预后的评估，通常依据肿瘤细胞的病理学分级。但实践表明，许多临床表现和病理形态学相似的肿瘤患者，其预后往往很不相同，这表明临床表现和病理形态并不能真正反映肿瘤的生物学特征。从分子生物学的观点来看，肿瘤恶性程度与其细胞的增殖速度密切相关。细胞增殖活跃者，其生物学行为不佳，预后不良。

　　磁共振是一门正处于迅速发展的影像诊断技术，由于其独特的成像原理，可在一定程度上反映受检组织的病理生理学特征。笔者对26例肺癌患者采用不同MR成像序列，测量肿瘤组织的相对MRI信号强度，并用免疫组化的方法测量手术标本的增殖细胞核抗原(PCNA)阳性细胞数，对二者进行统计学比较，以期从MRI信号特点来推断肿瘤细胞的增殖活性。

　　1　材料与方法

　　1.1　一般资料

　　1998年4月～1998年12月26例肺癌患者行MRI检查，其中男性22例，女性4例。年龄40～76岁，平均60.38岁。所有病例均经手术病理证实(包括鳞癌、腺癌各13例)，其中23例应用2种以上的证实方法，包括痰细胞证实4例，颈淋巴结活检证实1例，纤维支气管镜证实20例。所有患者术前均未行化疗、放疗及介入治疗，于MRI检查后2周内手术。

　　1.2　MRI检查

　　使用Resonex 0.38T磁共振成像系统，工作频率16MHz，扫描时采用体部线圈，患者仰卧，以7～10mm层厚行冠状面及横断面成像，必要时行矢状面成像。冠状面扫描时用15^°～20^°的前倾角，以使切面与气管平行。使用SE序列，全部应用心电门控技术，矩阵256×256，FOV 35cm。T₁WI、GR序列平扫后静脉一次注入Gd-DTPA，剂量为0.1mmol/kg体重，1分钟内注射完毕，注药后即刻扫描。本组增强后常规只作T₁WI扫描。

　　本实验分别测定增强前、后T₁WI以及GR序列3个序列中肺癌肿块实质部位的信号强度，同时测定相应水平椎体的信号强度，每个感兴趣区分别测量3次取其平均值，以减少误差，然后计算出肺癌病灶与椎体的相对信号强度比(SI_ratio=SI_病灶/SI_椎体)，并计算注射Gd-DTPA后病灶相对信号强度比的增加值(SI_rel=(SI_Post-SI_Pre)/SI_Pre)。为保证测量准确，应保持磁场均匀，测量时尽量选择信号均匀、无坏死区，以避开运动伪影，测量范围在30以上，以减少误差。兴趣区(ROI)范围、大小、部位，增强前后均保持不变。

　　1.3　手术后标本PCNA测定

　　取手术标本肿块实质部分约1.0cm×1.0cm×0.2cm大小，置入10%中性福尔马林液，固定24小时后脱水，石蜡包埋。选用抗PCNA单克隆抗体PC-10(美国，Dako公司产品)，用ABC酶标染色。石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度酒精水化；用小牛血清(1∶100)滴片，室温下孵育20分钟；滴加PC-10 McAB(1∶50)，4℃冰箱过夜；滴加生物素化二抗，室温下45分钟；滴加ABC免疫复合物，室温下45分钟。上述各步均以TBS缓冲液冲洗3次，2～3分钟/次；DAB-H₂O₂显色10分钟，水冼，苏木精复染，盐酸酒精脱水，透明，中性树胶封片。

　　通常以细胞核呈界限清楚的棕褐色反应作为阳性，PCNA染色结果判定，是选择切片中最有代表性的视野，在放大200倍显微镜下，计数1000个癌细胞中PCNA的阳性细胞核数，并计算出增殖指数PI(PI=PCNA 阳性细胞数/1000)。PI≤5%者视为阴性，PI＞5%者为阳性^［1］，作为本组研究对象。朱红等^［2］将PCNA阳性表达分为3级(Ⅰ级：PI≤25%，Ⅱ级：26%～75%，Ⅲ级：76%～100%)，以此作为评估细胞增殖状态的标准。李同度等^［3］则将PI＞20%视为高表达增殖。鉴于至今未有一个统一标准，本组将5%＜PI≤50%视为增殖较活跃，PI＞50%为增殖异常活跃。

　　每例肺癌不同MRI序列的SI_ratio、SI_rel及ABC法测得的PCNA(PI)都以均数±标准差(±s)表示，所有结果均进行t检验。

　　2　结果

　　2.1　不同增殖活性的肺癌在MRI不同序列中的信号强度比见表1

　　本组5%＜PI≤50%有3例，PI＞50%有22例(图1、2)

表1　原发性支气管肺癌MRI信号强度与PCNA的关系

　　注：* P＜0.05，有显著性差异

　　2.2　不同MRI形态的肺癌PCNA值见表2

表2　原发性支气管肺癌形态特征与PCNA的关系

　　注：经t检验，P均＞0.05，无显著性差异。△ 余6例为中央性肺癌，伴有阻塞性肺炎、肺不张等改变

　　3　讨论

　　MRI信号强度主要与下列3个参数有关：(1)T₁：纵向弛豫时间。 (2)T₂：横向弛豫时间。 (3)P：核密度。目前研究认为各种病变之T₁、T₂值均有较大重叠，单凭T₁、T₂值测量进行鉴别诊断是不可靠的，但通过信号强度差异可大体区分肺恶性病变及继发病变。由于肺癌有较丰富的血供，与一般肿瘤组织一样具有较高的毛细血管通透性及较大的细胞外间隙，应用Gd-DTPA增强可提高肺部良、恶性病变及继发病变的鉴别诊断。刘士远等^［4］将肺癌肿块实质区的信号强度与相应水平的椎体比较，观察肿块随MRI序列改变的信号变化情况，发现根据肿块的信号结构及信号的变化模式，可以大致区分肺癌的不同组织类型，尤其是鳞癌与腺癌。鉴于此，本组中也采取上述方法。

图1A　男，65岁。右下叶高分化鳞癌，PCNA阳性定位在细胞核，胞核呈界限清楚的棕褐色反应(↑)。PI(PCNA)=50% ABC×400

图2A　女，57岁，右中叶高分化腺泡状腺癌。见胞核呈界限清楚的棕褐色反应(↑)。PI(PCNA)=80% ABC×400

图1　B.增强前T₁WI，SI_ratio=0.994(↑)，肿块约5cm×4cm×3cm。C.增强后T₁WI，病灶有强化(↑)。SI_ratio=1.117

图2　B.增强前T₁WI，病灶呈中等信号，SI_ratio=0.957。C.增强后T₁WI，病灶略有强化，SI_ratio=0.962

　　肿瘤群体增殖动力学参数对研究肿瘤生物学特征及判断预后具有重要价值。在细胞周期中，一些蛋白质的合成，对于细胞从G₀期进入S期是必需的，如降钙素、P₅₃和PCNA等。PCNA是一种核内蛋白质，是δ多聚酶的一种辅酶，它的出现与细胞增殖有关，在静止期其量很少，G₁晚期开始增加，S期达到高峰，G₂、M期明显下降，因此，它可作为评价细胞增殖状况的一个指标^［5］。PCNA只在正常组织增殖部位表达(如淋巴结的生发中心、鳞状上皮基底层等)^［6］。如肿瘤细胞表达增强，表达过高，则意味着肿瘤预后差。有关肺癌的PCNA研究，大多是从免疫病理学角度来探讨PCNA与肺癌生存率、DNA含量、TNM分期等的内在联系，而有关MRI信号强度与PCNA的关系，尚未见报道。

　　本组结果表明，增殖异常活跃的肺癌细胞(PCNA＞50%)与增殖较活跃者(PCNA≤50%)之间，SI_rel存在显著性差异，即增殖活性较低的肿瘤细胞，可吸收较多的Gd-DTPA，增强后其信号上升较快。Strich等^［7］认为不同组织血供、毛细血管通透性和细胞外间隙差异，是MRI组织强化程度差异的病理基础。笔者同意Strich等的观点，肿瘤吸收Gd-DTPA的差异主要与肿瘤血供有关。即生长速度快、侵袭性强的肿瘤细胞，瘤体血供比例小于瘤体的生长速率，故较增殖慢的肿瘤细胞，吸收Gd-DTPA相对为少，从而导致SI_rel小于增殖相对较慢的肺癌细胞。因此MRI可量化地比较不同患者肺癌细胞的生物学行为。这与Stomper等^［8］的观点相同，他们在侵袭性乳癌的MRI研究中，发现DNA合成期分数高的乳癌，MRI表现出外周强化，表明增殖活跃的肿瘤细胞，肿块中心部分的血供较少，瘤体的血供比例相对低于瘤体的生长速率。

　　本组肺癌病例的MRI形态学特征(肿块直径、分叶征、毛刺征、瘤体坏死)与PCNA之间未发现有显著关系(P＞0.05)。肿块直径与PCNA的关系，有较多的学者做过不同的研究，如王恩华等^［9］对96例手术肺标本进行了PCNA分析，发现PI与肿块大小无关，但部分结果表明PI与肿瘤局部淋巴结及远隔部位转移，即TNM分期中的淋巴结(N)和远处转移(M)有关。

　　文献报道，石蜡切片的PCNA免疫组化检测，会出现假阴性^［9］，这可能与福尔马林固定不及时或石蜡包埋、烤片等处理过程，使部分病例的PCNA丢失或被破坏有关。笔者遇见1例，经6次ABC测定，仍呈阴性反应，失败原因估计为上述因素所致。

　　由于MRI信号的特征与T₁、T₂及核密度密切相关，因此，可用于研究瘤体的组织特性，间接推断其分子生物学及分子病理学的特征。国内、外已在这方面作了一些工作。本研究仅是一个初步的探索，今后还应进一步深入，如使用高磁场的MRI机型，做到多平面快速动态MR成像，使病理取材检查与图像扫描层面之间更为吻合，并研究组织固定、包埋、烤片等的最佳技术，以及与临床观察结合起来，从而进一步探索MRI影像与肺癌生物学行为之间的关联。

　　许冬明　研究生

　　参考文献

　　1，王恩华，刘闺男，郝明昌.增殖细胞核抗原表达与图像分析在判断肺癌预后上的应用.中华病理学杂志， 1995， 24：143

　　2，朱红，扬梅怀，张岩峰，等.肺癌增殖细胞核抗原表达及与DNA含量、AgNOR关系的研究.中华病理学杂志， 1997， 26：303

　　3，李同度，张荣新，刘德纯.增殖细胞核抗原对乳腺癌预后的意义.实用肿瘤杂志， 1996， 11：202

　　4，刘士远，肖湘生.磁共振信号强度区分肺癌组织类型的可行性研究.中华放射学杂志， 1996， 30：245

　　5，Yu CCW, Fletcher CDM, Newman P,et al. A comparison of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) immunostaining, nucleolar organizer region (AgNOR) staining, and histological grading in gastrointestinal stromal tumors. Journal of Pathology, 1992, 166:147

　　6，Hall PA, Levison DA, Woods AL,et al. Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) immunolocalization in paraffin sections: An index of cell proliferation with evidence of deregulated expression in some neoplasms. Journal of Pathology, 1990, 162:285

　　7，Strich G, Hagan PL, Gerber KH,et al. Tissue distribution and magnetic resonance spin lattice relaxation effects of Gadolinium-DTPA. Radiology, 1985, 154:723

　　8，Stomper PC, Herman S, Klippenstein DL,et al. Invasive breast carcinoma: Analysis of dynamic magnetic resonance imaging enhancement features and cell proliferative activity determined by DNA S-Phase percentage. Cancer, 1996, 77:1844

　　9，黄杰雄，黄致志.增殖细胞核抗原的研究进展.国外医学*生理、病理科学与临床分册， 1994， 14：9

(收稿：1999-04-26)