DR-70TM肺癌免疫测定取得可靠试验结果的关键步骤
数理医药学杂志 1999年第4期第12卷 临床科研分析
作者：吴东方 周新 恩格尔.戴特 安德森.吉娜 弗恩茨.阿里西亚 斯赖特.M.莱文斯纳里斯福.迪耶 吉姆恩斯.帕鲁 高波史夫.汤姆
单位：湖北医科大学附属第二医院 武汉430071
关键词：DR-70TM；免疫测定
摘 要 中国和美国用DR-70TM(肿瘤标志物)免疫试剂在检测393例健康对照及203例肺癌中的实用性的一个多中心研究，同时也进行了不同疾病和血液收集方法对DR-70TM试验产生干扰的调查。研究发现良性和非癌性疾病能引起DR-70TM水平的提高。
1 临床样本
1.1 在中国的研究
对照组335例样本来自湖北医科大学附属第二医院进行健康体检者。所有血清经静脉穿刺术获得并注入含凝血激活剂SST管中。其中男性190例，女性145例。年龄分布在15～70岁之间。所有人的血清都通过甲、乙、丙型肝炎和梅毒的检测，均为阴性。且具有正常的肝、肾及肺功能。
在83例肺癌患者中，男性55例，女性28例。均为我院进行治疗的临床病人，且都通过X光、B超、CT、活组织检查及外科手术等方法确诊的。其年龄分布在29～80岁之间。
1.2 在美国的研究
对照组58例血清来源于健康自愿者。
120例肺癌患者血清来源于奥斯汀医疗中心，其它良性及非癌症性患者血清来源于埃瑞文的加洲大学病理学系。
2 材料与方法
2.1 血清 除特殊说明外，所有血清均将经过如下步骤获得。早上空腹抽取大约2ml静脉血，注入有凝血激活剂的玻璃中，置室温30分钟以1500转/分离10分钟取出清澈血清进行分析。为便于比较，将采得血液注入不含凝血激活剂的空管中，制取一定的血清。
2.2 试剂 由美国AMDL公司提供。
2.3 仪器 水浴箱、进口洗板机及酶标仪。
2.4 试验原理 DR-70TM试验利用酶联免疫吸附(ELISA)法，用固定于小孔底部的纯亲和力多克隆抗DR-70TM抗体，去捕获稀释血清中的DR-70TM抗原，被捕捉的抗原，经洗涤后，与过氧化物酶标记的抗DR-70TM。轭合物结合成一个免疫三明治。用TMB显色，终止反应后，在酶标仪450nm处读取光密度，求其含量。
2.5 DR-70TM测定方法 所有的血清要用试剂盒中提供的稀释缓冲液稀释样本200倍。加血清5ul于1ml的稀释液试管中在充分混合后，将稀释血清加入到稀释板上的两个相邻小孔中，每个孔加入200ul。用一支8道的移液管，从稀释板上吸取100ul稀释血清至反应板相应的孔中，加盖封闭胶，在室温下孵育30分钟，然后上洗板机每孔300ul洗涤6遍，拍干，每孔加酶结合100ul，加盖封闭胶置室温下15分钟，再洗涤6遍，拍干后，每孔加TMB100ul，避免光直接照射，孵育5～10分钟显色。再每孔滴加100ul终止剂终止反应，上酶标仪读取光密度，利用试剂盒中5支标准品作直线回归制成标准曲线，再根据OD值查标准曲线求得DR-70TM含量。
3 结果
3.1 对照组中的血清DR-70TM水平
中国武汉和美国共同的研究中，393例健康对照个体中的正常血清DR-70TM水平波动范围在1mg/L至9mg/L之间。
3.2 肺癌患者的血清DR-70TM水平
在中国武汉研究中共有83例肺癌患者，DR-70TM水平在2mg/L至大于700mg/L。根据在335例对照组和83例肺癌患者的测定DR-70TM值，肺癌DR-70TM试验的特异性和敏感性参考可建立在不同的截点水平，见表1。
表1 DR-70TM肺癌免疫测定在不同截点水平的特异性和敏感性
| DR-70TM截点水平(mg/L) |
特异性% |
敏感性% |
| 6.0 |
97.6 |
62.0 |
| 5.5 |
97.6 |
67.5 |
| 5.0 |
96.7 |
73.5 |
| 4.5 |
94.9 |
86.7 |
| 4.0 |
89.0 |
88.0 |
| 3.5 |
88.4 |
89.2 |
| 3.0 |
86.9 |
95.2 |
| 2.5 |
83.9 |
97.6 |
| 肺癌患者总数：83 |
| 正常人总数：335 |
在美国的研究中，120例患肺癌者的血清中，其DR-70TM水平波动在1mg/L至51mg/L，利用58例对照组和120例肺癌患者的DR-70TM值，肺癌的DR-70TM试验的特异性和敏感性检测可建立如表2。
表2 DR-70TM肺癌免疫测定在不同截点水平的特异性和敏感性
| DR-70TM截点水平(mg/L) |
特异性% |
敏感性% |
| 16 |
100 |
65 |
| 12 |
99 |
76.6 |
| 11 |
98.1 |
78 |
| 10 |
98.1 |
82.5 |
| 9 |
96.2 |
85.8 |
| 8 |
93.5 |
86.7 |
| 7 |
88.8 |
90.8 |
| 6 |
72.2 |
95 |
| 5 |
45.3 |
97.5 |
| 4 |
10.1 |
98.3 |
| 肺癌患者总数：120 |
| 正常人总数：108 |
3.3 无凝血激活剂的空管在DR-70TM测量值中的影响
32例对照个体的血液分别收集在有和没有凝血激活剂的空管中，其结果血清的DR-70TM值分别立即和2倍时间间隔后进行分析，研究结果见表3。
表3 有凝血激活剂空管对无凝血激活剂空管两个时间间隔血清DR-70TM值对照
| 血清收集空试管 |
平均DR-70TM水平(mg/L) |
| 新鲜血清：置于室温30min |
室温5h |
室温48h |
| 有凝血激活剂的空管 |
5.71 |
6.13 |
6.33 |
| 无凝血激活剂的空管 |
5.64 |
6.53 |
6.92 |
3.4 导致血清DR-70TM水平升高的情况
已知某些良性、非癌性疾病情况可引起血清DR-70TM水平升高，它们包括肺炎、脓毒症、蜂窝组织炎、急慢性感染、烧伤、创伤、手术、肾功能不全、黄疸和类风湿关节炎等，其DR-70TM水平见表4。
表4 引起血清DR-70TM水平升高的情况
| 病例编号 |
临床诊断 |
DR-70TM(mg/L) |
| 1 |
感染 |
12.2 |
| 2 |
神经源性的膀胱炎 |
11.2 |
| 3 |
克雷伯杆菌膜炎 |
16.6 |
| 4 |
急性肺炎 |
20.8 |
| 5 |
50%体表烧伤(2度和3度) |
8.9 |
| 6 |
胸部手术创伤 |
20.6 |
| 7 |
肾功能衰竭 |
19.4 |
| 8 |
类风湿性关节炎 |
37.6 |
| 9 |
风湿性关节炎 |
8.8 |
| 10 |
蜂窝组织炎 |
20.0 |
| 11 |
脓毒症 |
15.2 |
| 12 |
黄疸 |
21.3 |
| 13 |
中毒性的肾功能衰竭 |
15.0 |
| 14 |
病毒性肺炎 |
33.4 |
| 15 |
复合型脑外伤 |
19.6 |
| 16 |
孕妇 |
13.0 |
| 17 |
泌尿系感染 |
16.0 |
| 18 |
肺结核 |
9.7 |
| 19 |
急性白血病 |
19.5 |
| 20 |
肝炎 |
10.2 |
4 讨论
为评估DR-70TM用于癌症检测的临床实用性的多中心研究已在三个国家进行(中国、美国和特立尼达)研究中包括了不同非癌症性疾病的影响和实验室因素可以影响DR-70TM试验的结果作相应的解释。
393例正常健康个体(335例在中国，58例在美国)的DR-70TM水平测得范围为1mg/L至9ml/L。血清DR-70TM水平值依赖于血清的获得方式将发生很大变动。例如，当血液注入无凝血激活剂的空管中，测定血清中的DR-70TM水平数值在获得5小时后将升高16%，48小时将增至20%。
另一方面，在相同的条件下，当血液取得后注入含有凝血激活剂的空管中，DR-70TM值将分别增至7%和11%。
一些非癌症性疾病如感染、烧伤、外科手术创伤、关节炎、脓毒症等也可使DR-70TM水平升高。这些效应能导致假阳性结果。因此，需要着重说明的是，DR-70TM免疫测定法检测有无肺癌时，患者必须明确有无前述疾病和使用正确的空管及血液收集方法。
当一个适宜的参考群体组，即没有上述非癌症疾病的正常健康个体和采用正确的血清收集法。DR-70TM肺癌试验经过ROC曲线分析显示可以取得令人满意的良好临床敏感性和特异性。
作者简介：恩格尔·戴特 安德森·吉娜 吉姆恩斯·帕鲁 美国加州AMDL公司
弗恩茨·阿里西亚 纳里斯福·迪耶 西印第斯大学化学系
斯赖特·M·莱文斯 奥瑞吉.加利弗尼亚大学医学系
高波史夫·汤姆 埃瑞克.威廉姆斯医学科学院妇产科系
参考文献
1 Wu,D., Zhou, X., Yang, G.,Xie Y., Hu, Wu., Yang, G., and Lu, M.,(1998), J. Immunoassay, 19(1),63～72.
收稿日期：1999-04-12
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