大肠癌人乳头瘤病毒感染与p53基因突变的关系

中华实验外科杂志 1999年第3期第16卷 简报

作者：李世拥　于波　安萍　马怡红　梁振家　苑树俊

单位：100700　北京军区总医院普通外科

　　我们采用PCR、PCR-SSCP技术，对大肠癌组织中人乳头瘤病毒(HPV)感染与p53基因突变进行分析，旨在探讨大肠癌发生与HPV感染和p53基因突变的关系，现报道如下。

　　一、对象与方法

　　1. 标本　我院1996年～1997年经手术切除大肠癌病人50例。术中切取新鲜癌灶标本立即置入液氮中贮存。术后均经病理组织学证实。高分化腺癌8例，中分化腺癌21例，低分化腺癌12例，粘液腺癌9例。

　　2. 组织中DNA的提取采用裂解液消化后，用酚-氯仿抽提DNA，无水乙醇沉淀，体积分数为75%乙醇洗涤，凉干，以三蒸水溶解DNA。

　　3. HPV检测　HPV反应体系，25 μl反应体系中含DNA模板5 μl,PCR反应液20 μl,Taq酶1 U。引物： HPV16、18晚期区共同引物，扩增片段为449 bp。HPV 16、18早期区特异引物，扩增片段分别为203 bp,244 bp。以上引物均由(北医大病理分子生物学实验室合成)。PCR反应： 94℃/45″、55℃/1′、72℃/1′，共35个循环。以电泳观察：制备1.2%琼脂糖凝胶，电泳后于紫外光透射下观察相应条带。

　　4. p53基因PCR-SSCP分析：反应体系同上。引物： p53基因第5、6、7、8、9外显子引物，(均由京师生物工程技术公司合成)其扩增片段分别为181bp、201bp、171bp、204bp、185bp。PCR反应：第5、6、7、8外显子为94℃/45″、56℃/45″、72℃/45″、第9外显子火温度为46℃/45″。共35个循环。SSCP检测：取10μl PCR产物，经热变性后上样于8%聚丙烯酰胺凝胶，垂直电泳，银染、显色后观察，出现异常条带者即为有突变。

　　二、结果

　　1. 50例标本中，检出有HPV16、18DNA相关序列者26例占52%，其中HPV16DNA4占例8.0%，HPV18

　　DNA22例占44.0%。两者检出率差异有非常显著性(P＜0.01)。

　　2. 50例标本中，共检出有p53基因突变者28例，占56.0%。其中第5外显子突变3例，第6外显子突变4例，第7外显子突变6例，第8外显子突变13例，第9外显子突变2例。第8外显子突变率较高(P＜0.05)。

　　3. 在26例HPV18、16DNA检测阳性者中，出现p53基因突变者19例，占73.1%。而在HPV18、16DNA阴性的24例中，有p53基因突变者9例，占37.5%。两组中p53基因突变率差异有显著性(P＜0.05)。

　　三、讨论

　　近年来的研究表明HPV感染与肺癌、宫颈癌的关系已被确认^［1］。1990年Kirgan等^［2，3］首次发现97%的结肠癌中有HPV壳抗原存在，经原位杂交分析显示约1/3壳抗原阳性组织存在HPV DNA。本组发现高危型HPV16、18DNA检出率为52%。其中HPV18DNA检出率为44%，表明HPV感染与大肠癌的发生有密切关系。

　　本实验结果发现，p53基因突变率为56%，然而高危型HPV16、18DNA序列检出阳性者中，出现p53基因突变占73.1%，提示高危型HPV16、18 DNA相关序列与p53基因突变呈正相关关系。原因可能在于高危型HPV18、16E₆蛋白与p53蛋白结合，可使野生型p53蛋白降解，E₆蛋白与野生型p53蛋白结合抑制其负性调节作用；HPV、DNA经插入方式整合到人染色体的某些位点，可致p53突变，突变的p53活性丧失，而出现促恶性转化活性；HPV蛋白产物E₇蛋白作用锌离子结合区，影响其反式激活及转化活性^［4，5］。但多数的证据表明高危型HPV感染与大肠癌发生有密切关系，HPV本身可能尚不足以诱导肿瘤的发生，而是与宿主p53基因突变相互作用。本组高危型HPV16、18 DNA感染者中p53基因突变占73%的结果显示了高危型HPV16、18DNA感染与p53基因突变之间，在肿瘤发生中可能相互起着协同作用。当然，大肠癌的发生是一个多因素、多步骤的过程，涉及到癌基因的激活和抑癌基因的失活。但对高危型HPV感染可能成为大肠癌发生的重要因素之一。

　　参考文献

　　1　Furihate M, ohtsuki Y, Ogoshi S, et al. Prognostic significance of human papillomavirus genomes (type-16,18) and oberrant expression of p53 protein in human esophageal cancer.Int J Cancer, 1993,54:226-227.

　　2　Kirgan D, Manalo P,Hall M, et al. Association of human papillomavirus and colon neoplasms. Arch Surg, 1990,125:862-863.

　　3　Kirgan D, Manalo P,cGregor M B. Immunohistochemical demonstration of human papillomavirus antigen in human colon neoplasms.J Surg Res, 1990,48：397-398.

　　4　Vousden KH, Vojtesek B, Fisher C, et al. HPV-16 E₇ or adenovirus E₁ A can overcome the growth arrest of cells immortalized with a temperature-sensitive p53. Oncogene, 1993,8:1697-1698.

　　5　Miranda T,paola M, John J, et al. HPV-18 E₆ mediated inhibition of p53 DNA binding activity is independent of E.induced egradation. Oncogen, 1995,10:261-262.

(收稿：1998-04-09　修回：1998-10-23)