大肠癌mdr1基因研究进展

江苏医药 1999年第2期第25卷 综述

作者：沈历宗（综述）　吴文溪　武正炎（审校）

单位：南京医科大学第一附属医院普外科（210029）

　　肿瘤多药耐药（MDR，multidrug resistance）是指肿瘤细胞对分子结构不同作用机制各异的抗肿瘤药物产生交叉耐药。MDR是肿瘤化疗取得成功的一大障碍。现已证实，MDR主要是由mdr1基因编码的Pgp（P-glycoprotein）引起的，Pgp是一种能量依赖性药物输出泵，将细胞内药物泵至细胞外，降低细胞内药物蓄积，导致化学治疗的效果下降乃至消失。本文就近年来大肠癌mdr1／Pgp的研究进展作一简要综述。

　　MDR表型的肿瘤细胞常有mdr1基因过度表达。mdr1基因是一组基因家族的成员，该家族中共有5个成员，其中3个存在于仓鼠（Pgp1，Pgp2，Pgp3）和小鼠（mdr1，mdr2，mdr3），只有2个见于人的细胞（mdr1，mdr3），已知人的2个基因中仅mdr1与MDR有关，这些mdr基因编码的蛋白质具有类似结构和75％～85％的同源氨基酸^［1］。人的mdr1基因位于7q21.1带330kb之中。mdr1 cDNA核酸序列分析显示该cDNA含4669kb，第179至第3840bp之间为可读区，起始密码为ATG，编码一含有1280个氨基酸的跨膜糖蛋白即Pgp^［2］。

　　Pgp分子量为170KD，故又称P-170，其蛋白质部分为140KD，糖部分为30KD。由几乎相等的两半部分组成，各具有相似的氨基酸序列。每侧都有一个疏水区和一个亲水区，疏水区各有成对排列的6个穿膜区，亲水区具有细胞转运蛋白的同源序列和ATP结合位点^［1］。ATP可与Pgp结合，结合位点突变可引起MDR表型丧失。穿膜区之间联连部分的氨基酸大多处于细胞浆内，仅有一小段暴露于细胞表面。蛋白质分子的N侧有10个潜在的N-糖基化位点，其中7个位于膜的胞浆侧估计不被糖基化，另外3个丛集于胞浆外。Kramer等^［3］发现用Tunicamgein阻断Pgp糖基化可减少MDR表型。现在普遍认为Pgp具有膜转运蛋白的功能，在胞浆部分由ATP供能，Pgp发生能量依赖性变构，通过跨膜区形成的疏水孔将抗肿瘤药物泵出胞外。但Pgp导致MDR的确切机制尚不十分清楚^［1］。

　　mdr1基因／Pgp可在正常肝胆管、胰管、小肠、大肠、远曲肾小管及肾上腺中表达。现在普遍认为Pgp的生理功能包括防御外源性毒物的侵害、分泌代谢产物、转运糖皮质激素、通过非经典途径分泌多肽(细胞因子)、转运离子及调节细胞体积。文献报道正常大肠粘膜mdr1／Pgp的表达率在96％～100％之间^［4］。但是人体正常组织器官中mdr1／Pgp表达量很低，而MDR表型的肿瘤细胞有mdr1／Pgp过度表达。不同组织起源不同种类的肿瘤其mdr1／Pgp表达水平不一致，根据其表达水平及频率可将人类肿瘤分为四类，大肠癌位列第一类在未径治疗时表达水平及频率最高组之首，文献报道人大肠癌mdr1／Pgp表达率在38％～96％之间^［1］。Chin等^［5］研究发现mdr1启动子是P53与C-H-ras的靶分子，野生型P53能抑制mdr1基因转录，而突变型P53增强mdr1启动子表达，Ras基因活化及P53基因突变是大肠癌最常见的遗传事件，因而揭示了大肠癌mdr1／Pgp高表达的原因。大肠癌Pgp的表达还受到器官微环境的影响，Dong等^［6］将鼠大肠癌细胞系CT-26注入18周龄的雌BALB／C小鼠，分别制成皮下移植瘤组及肺移植瘤组，注射后7日、14日分别对各组注入阿霉素（DOX）（实验组）及生理盐水(对照组)，21日处死，发现皮下瘤组DOX抑制率为80％，肺瘤组几乎为零，肺瘤组mdr1／Pgp高表达，具MDR表型，可被异搏定逆转，而皮下瘤组无mdr1／Pgp表达。

　　关于mdr1基因过度表达是否与MDR相关，许多学者做了大量工作。Yamauchi等^［7］体外研究证实mdr1基因表达强阳性的大肠癌细胞对DOX等交叉耐药。但也有作者发现mdr1 mRNA／Pgp的表达与MDR并非必然相关，而成熟的Pgp的磷酸化状态及其在细胞膜上的定位才是MDR必需的。

　　现已证实mdr1／Pgp介导的MDR是可以逆转的。MDR逆转剂可与抗肿瘤药物竞争Pgp上的结合位点，从而降低抗肿瘤药物的外流，增加细胞内药物的积累，使肿瘤细胞恢复对抗肿瘤药物的敏感性。目前发现的MDR逆转剂主要有异搏定、环孢素A、奎尼丁、三苯氧胺、类固醇激素、BSO、MRK-16、肿瘤坏死因子（TNF）、氯喹等。这些逆转剂都有以下共同的理化特性①亲脂性；②在同一平面具有两个或以上的芳香环；如连接则能增加疏水性的取代基，活性更强；③一个叔胺基；④在生理状况下带正电荷；⑤反式结构似乎活性更强^［8］。

　　大肠癌作为mdr1／Pgp高表达肿瘤之一，其MDR逆转研究是近几年的热点。为了深入研究大肠癌MDR，Iwahashi等^［9］用大肠癌细胞株HCT-15体外培养，通过递增培养液中DOX浓度，建立了耐DOX的大肠癌细胞模型，该模型可被异搏定逆转。Hoskins等^［10］用类似方法制成有mdr1 mRNA高表达且可被异搏定及Vindoline逆转的耐DAULB／Sulfate的大肠癌细胞模型Caco-2R。Heyden等^［11］体外研究发现5′-Deoxy-5-Fluorauridine（dFurd）能增加Pgp强阳性的大肠癌细胞株细胞内Daunorubicin的浓度。Quattrone等^［12］体外对大肠癌MDR表型细胞株Lovo／DX用10mM的反义寡核苷酸（ODNS）混合物处理，每24小时1次，共15天，复查发现mdr1 mRNA及Pgp均下降了50％。环孢素A、异搏定、Bepridil等也被发现体外有逆转大肠癌mdr1 mRNA／Pgp的作用。

　　在体外研究的基础上，许多学者进行了体内研究的探索。Verweij等^［13］静脉合用环孢素A及Epidoxombicin逆转人大肠癌mdr1／Pgp，发现使用后出现严重发热及白细胞减少等副作用。同样异搏定等用于人体，要达到与体外研究相似的逆转MDR的效果，其剂量是令人难以承受的。为了解决这一矛盾，许多学者在给药方法上作了改进。Saltz等^［14］对合并肝转移的大肠癌患者采用异搏定及DOX经动脉区域灌注来逆转MDR，这样可以减少全身给药的毒副反应，他们推荐异搏定浓度为7.3mM，给药速度为1mg·kg^－1.h^－1。Linn等^［15］对大肠癌患者先经门静脉置管给予Bepridi 5mg·kg^－1.1／2h^－1，随后以12mg／kg维持12小时，再5mg／kg维持24小时，在使用Bepridil 24小时后静脉注射VCR（长春新碱），结果显示Bepridil能够达到足够的血药浓度，而且维持时间较长，随访显示mdr1／Pgp均被显著逆转，本方案减轻了Bepridil的毒副作用。

　　许多学者近年还研究了逆转大肠癌mdr1／Pgp的其它途径。首先是采用免疫疗法，Sela等^［16］体外研究发现抗Pgp单抗MRK-16能逆转大肠癌MDR细胞株HT-29mdr1，Iwahashi等^［17］及Pearson等^［18］在人大肠癌裸鼠模型上也证实了MRK-16的逆转作用；Stein等^［19］及Seala等^［20］发现细胞因子如IFN-α，IL-α，TNF-α体外均可逆转大肠癌细胞mdr1／Pgp，使mdr1 mRNA及Pgp水平降低并增加细胞内药物浓度，为了避免TNF-α，IL-2直接静脉给药引起的负作用，Stein等还将TNF-α及IL-2基因转导给大肠癌细胞，使肿瘤细胞在其微环境内不断分泌释放细胞因子从而降低全身给药的副作用。其次是脂质包裹的抗肿瘤药物的应用，研究发现脂质体包裹的DOX比单纯DOX在治疗MDR表型的人白血病及乳腺癌时更为有效；Sela等^［16］及Oudard等^［21］分别将脂质体包裹的DOX用于人大肠癌MDR细胞株，均发现DOX细胞内蓄积增加，细胞毒作用增强，但DNA断裂在脂质包裹DOX与DOX间并无差别，提示脂质包裹DOX增加细胞毒性可能是某些次要的非DNA靶位决定的。另外Pannoechia等^［22］研究了EIPA――一种选择性Na^＋／H^＋交换抑制剂对大肠癌耐药细胞系LOVO／DOX的作用，发现EIPA在10mM至50mM之间能恢复细胞内DOX蓄积，增加DOX对细胞增殖的抑制作用，这一研究展示了一种全新的逆转mdr1的机制。

　　总之，大肠癌mdr1基因／Pgp的研究为我们提高防治大肠癌的效果提供了一个突破点，MDR逆转剂的临床应用也取得了初步成果。但是大肠癌MDR具有多因素多机制的特点(大肠癌MDR尚有其它机制参与，作者将有另文述及)，mdr1基因／Pgp本身也有许多问题尚未彻底阐明，至今尚未发现一种作用可靠且副作用小的逆转剂，因此MDR逆转剂要想取得良好的疗效，尚需一个过程。但我们可以预见MDR逆转剂的合理应用将会使肿瘤的治疗效果跃上一个新的台阶。

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