蛋白激酶C和环磷酸腺苷在胃癌细胞凋亡中的变化特点及意义

中华核医学杂志 1999年第4期第19卷 临床与实验研究

作者：邢承忠　陈峻青

单位：沈阳,中国医科大学第一临床学院肿瘤科　110001

　　在细胞信号多条传导通路中,蛋白激酶A-环磷酸腺苷(PKA-cAMP)和二酰基甘油-蛋白激酶C(DG-PKC)是研究较为清楚的2条通路^［1］。而cAMP和PKC是这2条信号传导通路中重要的信号分子,它们广泛参与细胞的信息传递和肿瘤细胞的生长、分化、增殖等过程。本实验用顺铂诱导胃癌细胞凋亡,动态观察其细胞凋亡过程cAMP和PKC的变化特点,探讨胃癌细胞凋亡的信号传导机制。

　　材料与方法

　　一、试剂

　　RPMI 1640为美国Life Tech公司生产;顺铂为山东齐鲁制药厂生产;碘化丙啶、RNA酶、磷脂酰丝氨酸(PS)和甘油二脂(DG)为美国Sigma公司产品;γ-³²P-ATP为北京市福瑞生物工程公司产品;¹²⁵I-cAMP RIA试剂盒为上海中医药大学产品。

　　二、方法

　　1. 细胞培养。人胃癌细胞系BGC823(由北京医科大学引进)复苏后培养于含质量分数为10%小牛血清的RPMI 1640营养液中,2～3 d传代1次。取对数生长期细胞,加顺铂至终浓度为2 μg/mL,选择不同时间点用光镜、常规透射电镜和扫描电镜制片观察细胞凋亡的形态学变化。收集各时间点细胞(10⁶个),提取DNA,用含溴化乙锭的质量分数为1.5%琼脂糖电泳观察DNA条带,照相;收集时间点细胞(10⁶个),制成细胞悬液,用流式细胞仪进行细胞周期分析,激光激发波长为488 nm^［2］。

　　2. cAMP检测方法。将生长状态较好的细胞接种于24孔板培养,分对照组(未加药组)、加顺铂诱导凋亡组(加药后30 s～24 h),稀释成2×10⁴个细胞/mL,最终反应体积为1 mL,沸水中煮沸3 min终止反应,取50 μL(含10³个细胞)缓冲液置于-20 ℃冻存待测cAMP。按¹²⁵I-cAMP试剂盒说明书操作。每一时间点重复6次,取平均值。

　　3. PKC活性检测方法。用竞争蛋白结合法,每一时间点重复6次,准确性和精确性可靠。对照组及顺铂诱导凋亡组(不同时间)收集细胞后用预冷的PBS洗2次,加Buffer A 1 mL(20 mmol^．L^-1Tris/HCl,pH值7.5,质量分数为0.25%蔗糖,10 mmol^．L^-1EGTA,20 mmol^．L^-1EDTA),用超声粉碎机粉碎,每次20 s,共5次,然后4 ℃ 1×10⁵×g离心1 h,上清为胞浆PKC部分,沉淀部分加含质量分数为1% Triton-100的Buffer A抽提胞膜PKC 30 min,每10 min振荡1次,然后超声粉碎,4 ℃ 1×10⁵×g离心1 h,取上清液,为胞膜PKC部分。PKC活性包括胞浆和胞膜的活性。取上述胞浆或胞膜PKC部分的样品,反应总体积0.25 mL,含质量分数为1%的鱼精蛋白,0.5 mol/L Tris/HCl,pH值7.5,2.5×10^-4mol^．L^-1 ATP,0.25 mol^．L^-1醋酸镁,0.75 mmol^．L^-12-巯基乙醇,18.5 GBq γ-³²P-ATP,反应以加³²P开始,30 ℃水浴中反应30 min,以3 mL体积分数为1%的冷三氯醋酸终止反应,微孔滤膜抽滤,将滤膜放入含10 mL蒸馏水的液闪瓶中,于液闪仪中测放射性,蛋白质定量用Lowry法,PKC活性单位用pmol^．mg^-1．min^-1表示。

　　数据以±s表示,并行t检验。

　　结　　果

　　1. 顺铂诱导胃癌细胞系BGC823凋亡及其检测。加顺铂至终浓度为2 μg/mL诱导凋亡,加药后24 h出现典型凋亡改变。相差显微镜见细胞核浓缩,细胞变圆,胞膜突起起泡,细胞完整,见凋亡小体;透射电镜见核染色质积聚边集,呈新月形或帽状,细胞器结构清晰,胞浆浓缩或裂解成质膜包绕的碎片;扫描电镜见细胞变圆,胞膜突起起泡,胞核浓缩;琼脂糖凝胶电泳见电泳带上呈现一定间隔的梯状条带,对照组无此特征;流式细胞仪见G₁峰左侧出现亚二倍体细胞群的峰型。

　　2. 胃癌细胞凋亡各阶段cAMP浓度。用顺铂诱导胃癌细胞凋亡,对照组cAMP值为(0.021 3±0.004 1) pmol/10³细胞,加药后30 s cAMP浓度(0.023 5±0.003 4) pmol/10³细胞,呈上升趋势,但差异无显著性(t=0.72,P＞0.05),加药后6～24 h cAMP浓度为(0.037 1±0.001 9)～(0.029 9±0.002 7) pmol/10³细胞,高于对照组,差异有显著性(t＞3.19,P＜0.05)。

　　3. 胃癌细胞凋亡各阶段PKC活性。对照组为(157.20±11.53) pmol^．mg^-1．min^-1,加药后2～24 h下降明显,为(123.38±11.93)～(105.26±14.15) pmol^．mg^-1．min^-1,t＞3.58,P＜0.05。

　　讨　　论

　　研究表明,胞浆3个主要信号传导系统为cAMP系统、肌醇脂质系统和钙-钙调蛋白系统,而cAMP和PKC是PKA-cAMP和DG-PKC信号传导通路的主要信号分子,参与细胞的信息传导和肿瘤的生长、分化、增殖等过程。既往肿瘤细胞凋亡机制研究大多集中于凋亡基因调控机制方面,包括促进和抑制凋亡的基因。顺铂诱导细胞凋亡的作用靶点为肿瘤细胞核DNA,本研究对顺铂诱导细胞凋亡过程中信号传导机制进行了研究。

　　细胞内cAMP含量甚微,在不受刺激的情况下小于0.1 nmol/mg,cAMP的合成和分解分别由腺苷酸环化酶(AC)和磷酸二脂酶(PDE)调控,当AC活化时,促进ATP转化为cAMP,使cAMP含量升高;当PDE活化时,使cAMP分解为5′-cAMP而失活,使cAMP含量下降。cAMP作为第二信使参与细胞的增殖、分裂、脂肪分解等多种生命活动^［1,3］。本研究用顺铂诱导胃癌细胞凋亡,动态检测凋亡各阶段cAMP的变化,结果显示,随着凋亡的发生,cAMP呈上升趋势,特别在反应6 h后,表明cAMP参与细胞凋亡的信号传导,且呈上调趋势。有研究表明,肿瘤细胞增殖时cAMP呈下降趋势,而用化疗药物抑制其生长时,cAMP含量升高^［4,5］。David等^［6］研究细胞凋亡时cAMP的变化发现,用糖皮质激素诱导胸腺细胞凋亡,cAMP含量升高。胃癌细胞凋亡时亦发现cAMP升高。因此,通过提高胞浆cAMP来诱导肿瘤细胞凋亡和抑制其增生,将成为胃癌治疗研究的新线索。

　　PKC是一种Ca²⁺激活的磷脂依赖性蛋白激酶,它在信号传导及细胞增殖中起关键作用^［7］。蛋白激酶C不仅与肿瘤的增殖、分化相关,也与肿瘤细胞凋亡有关,它在肿瘤发生、发展、转移和凋亡过程中具有重要作用^［8］。本研究用顺铂诱导人胃癌细胞系BGC823凋亡,检测凋亡各阶段PKC活性的动态变化,结果发现,PKC活性均呈下降趋势,表明PKC参与胃癌细胞凋亡的信号传导。PKC作为抗肿瘤药物作用的靶点已受到人们的重视,通过抑制PKC活性可以降低肿瘤细胞的凋亡阈值,同时也发现抑制PKC活性可以对抗肿瘤药物^［9］。因此,本研究通过检测PKC在胃癌细胞凋亡过程中的动态变化,阐明了PKC在胃癌细胞凋亡过程中的变化特点。

　　本课题获沈阳市科委基金资助(基金编号:9849340521)

　　参考文献

　　1　曹泽毅, 主编. 激素受体及临床应用. 北京: 北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社, 1993. 48-70.

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　　3　刘景生. 细胞的信息传递及第二信使. 生理科学进展, 1987, 4:367-374.

　　4　Mestdah N, Vandewalle B, Hornez L, et al. Comparative study of intracellular 　calcium and adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate levels in human breast carcinoma cells sensitive or resistant to adriamycin contribution to reversion of chemoresistance. Biochem Pharm, 1994, 48:709-716.

　　5　张弘, 柳惠图. 钙调素拮抗剂对人肺癌细胞增殖抑制及与cAMP信号系统相关性之初探. 生物化学杂志, 1997, 13:469-473.

　　6　David J, McConke Y, Orrenius S, et al. Agents that elevate cAMP stimulate DNA fragmentetion in thymocytes. J Immuno, 1990, 145:1227-1230.

　　7　Nishiznka Y. The role of protein kinase C in cell surface signal transduction and tumor promotion. Nature, 1984, 308:693-698.

　　8　Schwartz GK, Haimovitz-Friedman A, Dhupar SK, et al. Potentiation of apoptosis by treatment with protein kinase C—special inhibitor safingol in mitomycin C treated gastric cancer cells. J Natt Cancer Inst, 1995, 87:1394-1399.

　　9　Chmura SJ, Mauceri HJ, Advani S, et al. Decreasing the apoptotic threshold of tumor cells through protein kinase C inhibition and sphingomyelinase activation increases tumor killing by ionizing radiation. Cancer Res, 1997, 57:4540.

（收稿：1998-11-13　　修回：1999-01-22）