B7-1基因修饰的肿瘤细胞瘤苗抗小鼠胃癌效应的实验研究

　　第三军医大学学报1999年第21卷第1期

杨金亮　房殿春　黄晋生刘为纹

　　提　要；目的：探讨B7-1基因修饰的肿瘤细胞作为瘤苗对小鼠胃癌的治疗效果。方法：在已建立高表达B7-1分子的小鼠前胃癌细胞系MFC-B7的基础上，观察MFC-B7细胞体外激活脾淋巴细胞的能力，体内成瘤性变化及作为瘤苗对荷瘤鼠胃癌的治疗效果。结果：MFC-B7细胞在体外能有效诱导脾淋巴细胞的活化增殖和特异性CTL(Cytotoxic T lymphocytes)活性的产生，在体内的成瘤能力明显下降，作为瘤苗接种对荷瘤鼠胃癌有较好的治疗效果。结论：B7-1基因修饰的肿瘤细胞免疫原性明显增强，有希望作为瘤苗用于此类肿瘤的治疗。

　　关键词：B7-1基因　胃肿瘤　免疫治疗　基因治疗

　　T细胞是机体的主要抗肿瘤效应细胞，而T细胞的有效活化至少需要两个信号^［1］。尽管多数肿瘤细胞能够把抗原通过MHC-Ⅰ类分子呈递给CD8⁺T细胞，但由于肿瘤细胞本身缺乏B7等辅助刺激分子或其表达低下，不能为T细胞活化提供所必需的辅助刺激信号，而使T细胞处于无反应状态，最终发生免疫逃避^［2，3］。B7(B7-1，B7-2)是目前已知最重要的辅助刺激分子，采用基因转染方法使肿瘤细胞表达B7分子，有可能通过增强或添加辅助刺激信号，有效地激发机体的抗肿瘤免疫。为此，我们在已建立高表达B7-1分子的小鼠前胃癌细胞系MFC-B7的基础上，进一步探讨了转染与表达B7-1分子的胃癌细胞能否有效地激发机体的免疫反应及作为瘤苗对荷瘤鼠胃癌的治疗效果。

　　1　材料与方法

　　1.1　细胞系

　　615小鼠前胃癌细胞系MFC，由中国医学科学院基础所提供。表达B7-1分子的MCF-B7细胞系，由本室建立并保存^［4］。

　　1.2　动物

　　615纯系小鼠，雌性或雄性，4～6周龄，18～20 g，购自中国医学科学院实验动物研究所。

　　1.3　MFC细胞特异性CTL的诱导和细胞毒活性的测定

　　CTL的诱导：采用肿瘤淋巴细胞混合培养法。常规分离鼠脾淋巴细胞，调细胞浓度至4×10⁶/ml，于6孔培养板上分别加入淋巴细胞2.5 ml及丝裂霉素灭活的肿瘤细胞1 ml(1×10⁶)培养5 d，其间半量换液1次，于第3、5天分别计数淋巴细胞1次。

　　CTL细胞毒活性测定^［5］：采用LDH释放法，在Beckman全自动生化分析仪上用速率法测LDH活性(IU/ml)，计算CTL活性。CTL活性(%)=(实验孔LDH活性-自然释放孔LDH活性)/(最大释放孔LDH活性-自然释放孔LDH活性)×100%。

　　1.4　MFC-B7细胞体内致瘤能力的观察

　　取12只4～6周龄的615小鼠(雄性)，随机分为2组，分别于右侧背部皮下注射MFC、MFC-B7细胞各2×10⁶(0.2 ml)。种瘤后每天观察记录肿瘤生长情况(触诊法)，待肿瘤结节长至约2 mm时(约6～10 d)，每隔3 d用游标卡尺测量一次肿瘤最大面积处的长径和短径，取二者平均值为肿瘤的直径。同时记录荷瘤鼠的存活时间。

　　1.5　MFC-B7细胞瘤苗治疗实验

　　荷瘤鼠制备：于每只鼠背部右侧皮下接种2×10⁶个MFC细胞(0.2 ml)(共24只鼠，雌性)，待肿瘤结节长至2～3 mm时，开始治疗实验。瘤苗制备：收获对数生长期的MFC和MFC-B7细胞，调浓度至5×10⁶/ml，用100 μg/ml丝裂霉素灭活2 h，洗去丝裂霉素，用无血清RPMI-1640调浓度至2×10⁷/ml，备用。瘤苗治疗及效果观察：接种亲本MFC细胞6 d时，肿瘤直径已长至2 mm左右，将24只小鼠随机分为3组(MFC-B7瘤苗治疗组、MFC瘤苗治疗组和对照组，8只/组)，于左侧背部皮下分别注射4×10⁶个MFC-B7细胞、4×10⁶MFC细胞和0.2 ml RPMI 1640培养液，共治疗2次，间隔1周，治疗开始后每天观察记录肿瘤生长情况。

　　1.6　统计学处理

　　采用t检验。

　　2　结果

　　2.1　MFC-B7细胞对脾细胞的活化增殖和特异性CTL活性的诱导作用

　　在肿瘤淋巴细胞混合培养实验中，MFC-B7细胞能有效地刺激鼠脾淋巴细胞的活化增殖，培养5 d后，鼠脾细胞平均增殖2.3±0.65倍，并产生了特异性的CTL活性，而MFC细胞无此效应，见表1。

表1　MFC-B7细胞对脾细胞MFC特异性CTL活性(%)的诱导作用

　　tab 1　The inductive effect of MFC-B7 cells on the

　　specific CTL of spleen cells

　　*:P＜0.05 vs a or b；E: Effect cell; T:Target cell； S.C:spleen cells; ND:Not determinate

　　2.2　MFC-B7细胞在体内的成瘤能力

　　皮下接种2×10⁶个MFC和MFC-B7细胞后，肿瘤出现的时间分别为(3.83±1.33)d和(6.33±3.20)d，二者差异不明显(P＞0.05)。但MFC-B7肿瘤在体内生长增速度明显慢于亲本MFC肿瘤(P＜0.05)，见图1，而且荷MFC-B7瘤小鼠的存活期明显延长(P＜0.05)，并有3只荷瘤鼠在30 d左右时肿瘤完全消退并长期存活(观察3月)。此结果说明MFC-B7细胞在体内的成瘤能力明显下降。

图1　MFC-B7和亲本MFC细胞在体内生长能力的评价

　　and parental MFC cells in vivo

　　2.3　MFC-B7细胞瘤苗接种对荷瘤鼠胃癌(MFC)的治疗作用

　　经MFC-B7瘤苗治疗后，肿瘤生长明显减慢，荷瘤鼠的存活期明显延长，并有37.5%(3/8)长期存活(观察3个月)，而MFC细胞瘤苗未显示出任何治疗作用(P＜0.05)，见图2、3。

图2　经MFC-B7细胞瘤苗治疗后荷瘤鼠肿瘤的生长曲线

　　fig 2　Curve of the therapeutic potential of B7-1-transfected MFC cells (MFC-B7) for mice bearing established parental MFC tumors

图3　经MFC-B7细胞瘤苗治疗后荷瘤小鼠的存活期

　　Fig 3　Survival period of mice bearing established parental MFC tumors treated by vaccine of MFC-B7 cells

　　3　讨论

　　近年来的研究认为，多数肿瘤细胞存在有肿瘤特异性抗原和/或肿瘤相关抗原，但仍能逃避免疫监视，其重要原因之一是：肿瘤细胞缺乏B7等辅助刺激分子，不能为T细胞活化提供所必需的第二信号^［2，3］。若能使肿瘤细胞表达B7分子，则可能逆转这种免疫无能状态而诱导肿瘤排斥反应。已有研究发现将人乳头状瘤病毒的E7基因(其表达产物作为抗原)和B7-1基因导入黑色瘤细胞系K1735，可使其致瘤性丧失，作为瘤苗接种可治愈40%早期荷瘤鼠的肿瘤^［6］。许多研究都得到了类似的结果^［7～10］，但这些研究仅局限于黑色素瘤、血液肿瘤等几种肿瘤。

　　在本实验中，我们将B7-1基因转染甲基苄基亚硝胺诱导的低分化、高转移的小鼠胃癌细胞株MFC，发现B7-1⁺MFC细胞免疫性明显增强，在体外不仅能诱导淋巴细胞活化增殖，还能诱导出特异性CTL活性，在同系鼠中成瘤性明显降低，作为瘤苗接种对早期荷瘤鼠的肿瘤有明显的治疗作用，表现为肿瘤生长变慢、生存期延长，甚至消退。这充分说明了B7-1基因转染的MFC细胞免疫原性增强，能启动并诱导机体产生强烈的抗肿瘤免疫反应，同时提示其对胃癌的转移也可能有抑制作用。

　　比较不同学者的实验结果，我们还发现，转染B7-1基因的肿瘤细胞所诱导的抗肿瘤免疫反应强弱程度相差很大，这可能是因为所选择的细胞系及实验条件不同所致^［6～10］。不同的肿瘤细胞免疫原性强弱、MHC分子和辅助刺激分子(如ICAM-1、LFA-3)表达水平不同，可能是导致所诱导免疫反应存在差别的主要原因。B7基因只有转染有免疫原性肿瘤细胞，才能诱导机体产生有效的抗瘤免疫反应，而且只有在肿瘤发生的早期(一般种瘤后1周以内)及肿瘤负荷较小时用瘤苗治疗才会收到较好的效果。

　　以上说明B7-1基因转染的肿瘤细胞能够启动并诱导机体产生抗肿瘤免疫反应，以此作为瘤苗用于防治人类此类肿瘤很可能有潜在的应用价值，值得进一步探索。

　　国家教委细胞增殖及调控生物学开放实验室开放课题基金资助项目

　　作者简介：杨金亮，男，30岁，主治医师，博士　　海军总医院中心实验科　北京，100000

　　作者单位：　第三军医大学附属西南医院消化内科　重庆，400038

　　 参考文献

　　［1］　Chen L, Linsley P S, Hellstorm K E. Costimulation of T cells for tumor immunity. Immunol Today,1993,14(10):483

　　［2］Chen L, McGowan P, Ashe S,et al. Tumor immunogenicity determines the effect of B7 costimulation of T cell-mediated tumor immunity. J Exp Med,1994,179(2):523

　　［3］　Hersey P, Si Z, Smith M J,　et al. Expression of the costimulatory molecule B7 on melanoma cells. Int J Cancer,1994,58(2):527

　　［4］　杨金亮，黄晋生，严明山，等.人B7-1分子能为小鼠淋巴细胞的活化提供辅助刺激信号.基础医学与临床，1997，17(6)：56

　　［5］　曹雪涛 主编.白介素2的基础与临床.北京：科学技术出版社，1990.136～137

　　［6］　Chen L, Ashe S, Brady W A,　et al. Costimulation of antitumor immunity by the B7 counter receptor for T lymphocyte molecules CD28 and CTLA-4. Cell,1992,71(11):1093

　　［7］　Townsend S E, Allison J P. Tumor rejection after direct costimulation of CD8⁺T cells. Science,1993,259(4):368

　　［8］　Li Y, McGowan P,Hellstrom I,　et al. Costimulation of tumor reactive CD4⁺ and CD8⁺T lymphocytes by B7, a natural ligand for CD28 can be used to treat established mouse melanoma. J Immunol,1994,153(2):421

　　［9］　Chen L, McGowan P, Ashe S,　et al. B7-1/CD80-transduced tumor cells elicit better systemic immmunity than wild type tumor cells admixed with corynebacterium parvum. Cancer Res,1994,54(22):5420

　　［10］　Townsend S E, Fannie W S, Atherton J M,　et al. Specificity and longevity of antitumor immune responses induced by B7-transfected tumor cells. Cancer Res,1994,54(24):6477