人肝癌裸鼠移植模型癌瘤及癌周组织雄激素受体的动态变化

中华外科杂志 1998年第9期第36卷 肝脏外科

作者：梁力建　周载平　吕明德　彭宝冈　卢汉平　殷晓煜　何强　黄洁夫

单位：510080 广州,中山医科大学附属第一医院肝胆外科［梁力建、周载平(研究生，现在广东中山市人民医院)、吕明德、彭宝冈、殷晓煜、黄洁夫］, 核医学教研室(卢汉平)；广州黄埔开发区医院外科(何强)

关键词：癌，肝细胞；受体,雄激素；小鼠，裸

【摘要】　目的　了解雄激素受体(AR)在肝癌(HCC)进展过程中的动态变化规律。　方法　使用人HCC裸小鼠原位移植模型，动态测定癌瘤及癌周组织的雄激素受体AR含量的变化。　结果　原位移植后4周90％的裸鼠可见瘤结节，10周见肿瘤坏死，12周癌瘤大片坏死。测定原位移植瘤AR，无论是癌瘤或癌周组织，其总量均在肿瘤生长初期最高，分别为102.32±21.42 fmol/mg蛋白和72.45±10.11 fmol/mg蛋白，然后随时间递减，到第10周为40.98±21.11 fmol/mg蛋白、53.39±7.01 fmol/mg蛋白，每2周之间差异均有显著的统计学意义。胞核和胞浆变化相同。　结论　雄激素在肿瘤的发生过程中由于AR的存在而起促进作用；在成瘤后雄激素的作用可能减弱，故在成瘤后再作抗雄激素治疗可能是无效的。

　　Dynamic change of androgen-receptor in tumor and surrouding liver tissue of nude mice model with transplanted human HCC Liang Lijian, Zhou Zaiping, Lu Mingde, et al.Department of Hepatobiliary Surgery, First Affiliated Hospital, Sun Yat-Sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510080.

　　【Abstract】　Objective　To research into the law of androgen-receptor (AR) dynamic change in developing course of human HCC.　Method　Dynamic measurement of AR in tumor and peritumorous tissue was performed in nude mice model with orthotopic transplanted human HCC.　Result　Tumor nodules were present in 90% nude mice 4 weeks after transplantation,tumor necrosis was found in the 10th week, and remarkable necrosis occurred in the 12th week. The quantity of AR in tumor and peritumorous tissue was highest in the early stage of tumor (102.32±21.42 fmol/mg protein and 72.45±10.11 fmol/mg protein respectively), and then decreased progressively with time to the 10th week (40.98±21.11 fmol/mg protein and 53.39±7.01 fmol/mg protein respectively). The difference in AR between each two weeks was significant. 　Conclusion　Androgen promotes the development of tumor because of existence of AR, and its action may decline after establishment of tumor. Therefore,antiandrogen treatment may be ineffective after establishment of tumor.

　　【Key words】　Carcinoma,hepatocellular　　Receptors,androgen　　Mice, nude

　　因为地区和种族差异的关系，雄激素和原发性肝癌(HCC)的确切关系还不太清楚。我们已经发现，广东地区中国人的HCC其癌瘤组织和癌周组织均可测出雄激素受体(AR)，而正常肝组织则几乎不能测出^［1］。我们用人肝癌裸鼠移植模型，在HCC的进展过程中动态测定了AR的变化，以了解AR的变化规律。

材料与方法

　　1．试剂：(1)³H-R1881和未标记R1881；SA 3.2TBq/mmol，放射性化学纯度98%(new england nuclear centre)。(2)缓冲液：见文献［1］。

　　2．动物：BALB/CA裸小鼠，雄性，8～9周龄，体重30±1 g(中科院上海药物研究所提供)，SPF(specific pathogen-free)条件下饲养。

　　3．模型复制和鉴定^［2］：（1）人肝癌标本：为一男性HCC患者,在本院手术切除的肝癌组织，病理为高分化型肝细胞癌(edmondson Ⅱ～Ⅲ级)，术前甲胎蛋白(AFP)13000 μg/L。（2）人肝癌异位移植瘤模型：取0.3 cm新鲜癌瘤组织块接种于雄鼠双侧腋窝皮下，瘤块长至1 cm开始接种传代，稳定传至8代，血清AFP保持高分泌性。(3)人肝癌原位移植瘤模型：8周龄的裸鼠以戊巴比妥麻醉后开腹，套管针吸取异位移植瘤块植入肝实质内。(4)模型鉴定：经光镜、电镜、AFP、免疫组织化学染色、细胞图像分析等确认裸鼠原位移植瘤保留人肝癌组织形态学特点。

　　4．标本切取：原位移植后第2周开始，每隔2周取移植鼠开腹，直视下切取肉眼癌瘤组织、离癌旁1 cm的无瘤肝组织各0.125 cm³，离体后立即置入液氮内保存。

　　5．AR的测定：用放射配基结合分析法测定^［1］。

　　6．结果分析：所有原始数据输入微机处理，计量资料以±s表示，用SAS软件作方差分析。

结果

　　1．大体观察：原位移植瘤术后2周无明显的瘤结节生长，4周后约90％裸鼠见瘤结节，直径0.5～2.4 cm不等。第8周、10周开始见少数样本肿瘤组织中出现坏死灶。12周时仅存3只荷瘤鼠，癌瘤大片坏死，因样本太少未纳入统计。

　　2．裸鼠原位移植瘤AR定量表达：AR测定结果见附表。无论胞核、胞浆或总的AR含量，癌瘤组织均高于癌周组织(P＜0.05)，其中第4、第6周差异有非常显著意义(P＜0.01)；无论癌瘤或癌周组织，胞核的AR含量均高于胞浆(P＜0.01)。

　　3．裸鼠原位移植瘤AR的浓度-时间效应：由附表可见，裸鼠原位移植的癌瘤及癌周组织，无论是总量、胞核或胞浆，在肿瘤生长初期(第2、4周)AR水平最高，然后呈明显的随时间递减性，AR总量的周次之间两两比较为4周＞6周＞8周＞10周，除第8与第10周外(P＞0.05),差异均有显著的意义(P＜0.05)。

讨论

　　既往研究AR与HCC 关系大多取材于临床病例的手术切除标本，这种AR测定不能动态反映两者的相互因果关系，更不能确切证明AR对HCC在哪些方面和哪一阶段产生影响。

　　人肝癌裸鼠原位移植模型，经各种检测和观察表明保留了人肝癌的组织形态学特点和生物学特性，更接近人体原发癌，是理想的肝癌研究的动物模型。文献和我们的研究表明，HCC中癌瘤组织的AR高于癌周组织，在亚细胞的分布空间上，胞核高于胞浆^{［1，3，4］}。肿瘤相对高的AR含量反映了HCC对雄激素有较高的敏感性。已有报告认为AR发生了亚细胞定位的功能改变。Friedman等^［5］认为雄激素在与胞浆AR结合后转移到胞核去影响细胞的增殖过程。这些都表明AR的存在是雄激素影响HCC 生长的有力证据。

　　诱癌实验表明，HCC 癌前期除肝硬变阶段肝脏AR略有下降外，随肝脏的高度增生结节到HCC的变化而逐步变化，总体量是递增的^［6］。目前已经公认，长期使用雄激素增加了发生HCC的危险性^［7］。因此，有人使用抗雄激素治疗HCC并认为有效^［8］，然而，也有人持反对意见^［9］。本实验发现，人肝癌裸鼠原位移植模型在癌瘤生长后，随着移植瘤的进展而AR呈递减的浓度-时间效应。第12周虽然未纳入统计，但三个样本AR均数为最低水平，除有可能因为肿瘤的坏死致AR下降外，还有可能随着肿瘤的生长，AR不断丢失，雄激素在HCC 的晚期已逐渐失去其促进癌细胞的增殖作用。从而也说明了，成瘤以后才使用抗雄激素治疗可能达不到预期的治疗效果。

　　最近有人报道，29个直径小于3 cm的HCC中22个检测出AR，而14个大于3 cm的仅有6个有AR存在，差异有显著的统计学意义^［10］。我们的实验也有相似的结果，推断雄激素在HCC的发生过程中有明显的诱发作用，可能雄激素与AR结合后，在胞核内影响某些基因的表达，促进肿瘤的发生，但促进肿瘤细胞增殖的作用则不明显。HCC切除后的复发率与HCC癌瘤AR含量无关，但与癌周肝组织存在AR有关，癌周组织无AR者复发率明显低于有AR者^［10］。本研究的预实验中，所有人肝癌在雌性裸鼠的原位移植或不生长或生长缓慢。因此，我们认为肝脏AR的存在及含量是HCC产生的重要条件之一。

附表　人肝癌裸鼠原位移植癌瘤及癌周组织的AR含量(fmol/mg蛋白)

　　注：^*2周时无肉眼可见的癌结节

　　本课题受广东省自然科学基金资助

参考文献

　　1梁力建，吕明德，黄洁夫，等. 原发性肝癌与癌周组织雄激素受体的临床研究. 中华肿瘤杂志，1996，18：214-217.

　　2彭宝冈，丁健，吕明德，等. 人肝癌裸小鼠原位移植模型的建立与鉴定. 中山医科大学学报，1997，17(增刊)：7-9.

　　3Eagon PK, Elm MS, Stafford EA, et al. Androgen receptor in human liver: characterization and quantitation in normal and diseased liver. Hepatology, 1994, 19:92-100.

　　4Ohnishi S, Murakami T, Moriyama T, et al. Androgen and estrogen receptors in hepatocellular carcinoma and in the surrounding noncancerous liver tissue. Hepatology, 1986, 6:440-443.

　　5Friedman MA, Demanes DF, Hoffman PG, et al. Hepatomas: hormone receptors and therapy. Am J Med, 1982, 73:362-365.

　　6Ostrowski JL, Ingleton PM, Underwood JCE, et al. Increased hepatic androgen receptor expression in female rats during diethylnitrosamine liver carcinogenesis. Gastroenterology, 1988, 94:1193-2000.

　　7Westaby D, Portmann B, Williams R. Androgen related primary hepatic tumors in non-fanconi patients. Cancer, 1983, 51:1947-1952.

　　8Forbes A, Wilkinson ML, Johnson PJ, et al. Response to cyproterone acetate treatment in primary hepatocellular carcinoma is related to a fall in free 5α-dihydrotestosterone. Eur J Cancer Clin Oncol, 1987, 23:1659-1664.

　　9Bleiberg H, Grimaldi C, Gay F, et al. Double blind clinical trial of antiandrogen therapy vs placebo in unresectable hepatocellular carcinoma(Abs). Proceedings 29th Annual Meeting Am Soc Clin Oncol, 1993,12:193-194.

　　10Boix L, Castells A, Bruix J, et al. Androgen receptors in hepatocellular carcinoma and surrounding liver: relationship with tumor size and recurrence rate after surgical resection. Hepatology, 1995,22:616-622.

　　（收稿：1997-10-30　修回：1998-06-10）