P2z受体在介导慢性淋巴细胞白血病细胞凋亡中的作用

中华血液学杂志 1998年第8期第19卷 论　著

作者：彭黎明　CJ Bradley　JS Wiley

单位：610041　华西医科大学第一附属医院医学检验专业(彭黎明)；澳大利亚墨尔本大学医学院Austin医院血液科(CJ Bradley,JS Wiley)

　　关键词： 受体，嘌呤能,P2z；细胞凋亡；白血病，淋巴细胞性，慢性

　　摘要　目的：研究嘌呤能P2z受体在介导慢性淋巴细胞白血病(CLL)细胞凋亡中的作用。方法：将表达P2z受体［P2z(+)］与不含P2z受体［P2z(-)］的两组CLL细胞分别同1.0mmol/L三磷酸腺苷(ATP)体外培养8小时，以电镜、DNA凝胶电泳和定量DNA 3′端TdT法检测细胞凋亡；并对ATP、苯甲酰苯甲酸ATP(BzATP)、2-甲基硫ATP(2MeSATP)、γ-硫代ATP(ATP-γS)及其它核苷的诱导效应和氧化型ATP(OxATP)、1-［N，O-二(5-异喹啉碘酰基)N-甲基-L-酪氨酰］-4-苯哌嗪(KN-62）的抑制效应做定量研究。结果：①P2z⁺细胞能在ATP诱导下呈现典型的细胞凋亡形态和DNA梯形条带；②不同的P2z受体激活剂可通过P2z受体诱导细胞凋亡并产生不同量的DNA降解片段，诱导能力的强弱顺序是BzATP＞ATP＞2MeSATP，而ATP-γS或其它核苷几乎无诱导能力；③OxATP和KN-62可完全阻止诱导剂诱导的细胞凋亡。结论：P2z受体在介导由ATP等诱导CLL细胞凋亡的过程中起着十分重要的作用。

　　Study on apoptosis of leukemic lymphocytes mediated by purinergic P2z receptors　Peng Liming^*，CJ Bradley, JS Wiley.^* Department of Laboratory Medicine, First Affiliated Hospital, West China University of Medical Sciences, Chengdu　610041

　　Abstract　Objective：To investigate the role of purinergic P2z receptors in human leukemic lymphocyte apoptosis induced by extracellular adenosine triphosphate (ATP). Methods: Eleven B-CLL patients were studied. Leukemic lymphocytes with (n=8) or without (n=3) P2z receptors were exposed in vitro to ATP, benzoylbenzoic-ATP (BzATP), 2-methylthio-ATP(2MeSATP), adenosine-5′-［γ-thio］ triphosphate (ATP-γS), and other nucleosides for 8h. Apoptosis was detected by electron microscopy (EM), agarose gel electrophoresis, and quantitative TdT assay. Results:Apoptosis was detected only in leukemic lymphocytes with P2z receptors. By using the quantitative assay, ATP-inducing DNA strand breaks were found to occur specifically for BzATP, ATP and 2MeSATP, but not for ATP-γS and other nucleosides. Meanwhile, ATP-inducing DNA fragmentation was fully blocked by pretreatment with oxidized ATP (OxATP), a compound recently shown to block P2z receptors. Ca^2＋/Calmodulin complex played a role in the regulation of the CLL cell apoptosis induced by ATP, because an antagonist of this complex, 1-［N,O-bis (5-isoquinolinesulfonyl)-N-methyl-L-tyrosyl］-4-phenylpiperazine (KN-62)，was found to inhibit the ATP-inducing apoptosis. Conclusion: P2z receptors on lymphocytes play an important role in the apoptosis induced by ATP in vitro.

　　Key words　Receptor, purinergic, P2z　　Apoptosis　　Leukemia, lymphocytic, chronic

　　现已证实P2z受体在免疫与造血系统起源的细胞，尤其是在部分慢性淋巴细胞白血病(CLL)细胞膜上呈高表达，但其功能仍不清楚^［1，2］。我们以P2z受体的激活剂——三磷酸腺苷(ATP)、苯甲酰苯甲酸ATP(BzATP)等与抑制剂——氧化型ATP(OxATP)作用于表达P2z受体［P2z(+)］与不含P2z受体［P2z(-)］的CLL细胞，并采用电镜、DNA凝胶电泳、脱氧核糖核酸末端转移酶(TdT)介导的α³²P-dCTP定量标记DNA 3′-羟基末端(TdT法)技术检测细胞凋亡。观察P2z受体在介导细胞凋亡中的作用。

材料和方法

　　1　材料　ATP、BzATP、2-甲基硫ATP(2MeSATP)、OxATP、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)、三磷酸胞苷(CTP)、三磷酸鸟苷(GTP)和三磷酸尿苷(UTP)购自Sigma公司；1-［NO-二(5-异喹啉磺酰基)N-甲基-L-酪氨酰］-4-苯哌嗪(KN-62)为Res Biochemical产品；葡萄糖-泛影葡胺(Ficoll-Paque)、TdT和三磷酸双脱氧胞苷(ddCTP)为Pharmacia产品。P2z⁺细胞与P2z^-细胞均为B-CLL患者^［2，3］血标本。

　　2　方法

　　2.1　细胞表型和P2z受体的鉴定：CLL患者11例，P2z(＋) 8例，P2z(-) 3例，外周血用肝素抗凝，用Ficoll-Paque新鲜分离的淋巴细胞，经单克隆抗体(单抗)鉴定表型为CD₅^＋，CD₂₀^＋；同时，用荧光计(激发波长为340nm，发射波长为500nm)检测通过ATP作用CLL细胞膜P2z受体的阳离子通道，分析荧光染料呋喃-2-乙酰甲酯(fura-2)随阳离子(Ba^2＋)进入细胞量的多少以判断P2z受体的表达状态。ATP作用后Ba^2＋流入细胞内的数量低于5%为P2z(-)，高于20%为P2z(+)，且这种应答反应可被P2z受体特异的抑制剂(OxATP)完全抑制或被其激活剂(BzATP)增强^［2，3］。

　　2.2　细胞培养：将新鲜分离的P2z⁺细胞或P2z^-细胞悬浮于含40g/L庆大霉素、2mmol/L谷氨酰胺和10%灭活小牛血清的PRMI 1640培养液中，细胞浓度1× 10⁷/ml，并加入新鲜配制1.0mmol/L的ATP或其它核苷，置37℃，5% CO₂饱和湿度培养，取0，2，4，8小时细胞进行动态观察。

　　2.3　透射电镜标本的制备：培养细胞离心，用PBS洗2次后，用2.5%戊二醛于4℃冰箱固定30分钟，常规脱水，包埋，超薄切片，双铅染色。

　　2.4　DNA抽提和凝胶电泳^［4］：DNA抽提按标准的酚、氯仿、异戊醇抽提法进行。凝胶电泳取约1μg DNA样品，1%琼脂糖凝胶，5.0V/cm电泳3小时，溴化乙锭染色，在紫外线发射仪上观察并照相。

　　2.5　TdT法^［5］：①标记：20μl反应液中含5×缓冲液(Boehring-Mannheim公司产品)4.0μl, 25mmol/L氯化钴2.0μl， 500ng DNA, 62.5pmol ddCTP, 13.2pmol α-³²P-dCTP(Bresatec公司)。取2.0μl反应液做本底测定，加20U TdT，37℃ 60分钟。以0.5mmol/L EDTA 2.0μl终止反应。②标记物测定：取上述标记反应混合液2.0μl加入0.5mg/ml已标记小牛胸腺DNA(Sigma公司)液48.0μl中，用其中5.0μl测总放射性，在余下45.0μl中加入10%冷三氯醋酸(TCA)1.0ml，冰浴10～15分钟。用直径2.5cm的玻璃纤维滤膜(Whatman公司产品)过滤。以10% TCA 3ml洗滤膜5次，无水乙醇3ml冲洗3次；滤膜干燥后置于以甲苯为溶剂的闪烁液中，用液体闪烁计数仪CD300(Packard公司)测量其放射性。③计算：

　　2.6　统计学处理：采用微机分析。两组间比较用t检验，相关性检验用线性回归分析。

结果

　　1　形态学检查　P2z⁺细胞经1.0mmol/L ATP作用8小时后，在电镜下呈现典型凋亡细胞特征^［6］(细胞与核体积缩小，染色质浓缩致密，有新月体状核形成，细胞膜上的微绒毛消失等(图1)。然而，P2z^-细胞经同样处理后，却无凋亡细胞出现(图2)。同时，P2z受体特异的抑制剂OxATP(≥0.6mmol/L)可有效阻止凋亡细胞的产生；而且，根据电镜下凋亡细胞的形态标准^［6，7］，由二位有经验的实验人员采用双盲法，计数ATP作用不同时间的细胞300～500个。经1.0mmol/L　ATP作用P2z⁺细胞0，2，4，8小时的凋亡细胞百分率分别是0.20%，0.62%，2.30%，7.47%；线性回归分析结果表明，凋亡细胞与ATP孵育时间呈良好线性关系(r=0.99)。

↑指凋亡细胞

　　图1　经ATP处理的P2z⁺细胞(×2000)

图2　经ATP处理的P2z^-细胞(×2000)

　　2　DNA凝胶电泳　P2z⁺细胞与1.0mmol/L ATP、BzATP、2MeSATP分别作用8小时，均出现特有的DNA梯形条带，但是ATP-γS、ADP、AMP、CTP、GTP、TTP以同样方式作用后，均无DNA梯形带(图3)。同时，将P2z^＋细胞用0.6mmol/L OxATP 37℃1小时或1.0μmol/L KN-62 37℃，5分钟预处理，再与1.0mmol/L ATP作用8小时，仍无DNA梯形带出现。而且，P2z^-细胞用同样的方式作用后，也没有DNA梯形带出现，结果同电镜结果一致。

M为分子量标记；1为未经处理的阴性对照；4为P2z^-细胞加ATP；2，3和5～13为P2z⁺细胞经以下物质处理，2：KN-62加ATP；3：OxATP加ATP；5：TTP；6：GTP；7：CTP；8：AMP；9：ADP；10：ATP-γS；11：2MeSATP;12：BzATP；13：ATP

　　图3　琼脂糖凝胶电泳分析梯状DNA

　　3　DNA降解末端定量　以TdT法测定P2z⁺细胞分别用0，0.5，1.0，2.5，5.0mmol/L ATP作用8小时，DNA末端标记量分别为105200，263000，469050, 766639,1270950min^-1*μg^-1；经1.0mmol/L ATP作用0，2，4，8小时的DNA末端标记量分别是97600, 180900, 26680,469050min^-1*μg^-1。结果表明，DNA末端标记量与ATP浓度和作用时间呈密切正相关(r=0.98)。

　　将P2z^-与P2z⁺细胞以同样方式处理后，P2z⁺细胞DNA末端标记量显著高于P2z^-细胞(P＜0.05)；尤其当ATP浓度≥1.0mmol/L时差别更为显著(P＜0.01)；P2z^-细胞DNA末端标记量亦随ATP浓度增加而呈增高趋势，但与未加ATP的对照细胞相比较，其差异无显著性(P＞0.1)。

　　4　其它核苷对P2z⁺细胞的影响　用P2z受体的激活剂BzATP、ATP、2MeSATP、ATP-γS和各种核苷及ATP的同分异构体1.0mmol/L作用于P2z⁺细胞8小时，TdT法测定结果显示，诱导DNA降解的强弱顺序是BzATP＞ATP＞2MeSATP＞ATP-γS，而经ADP、AMP、CTP、GTP、TTP处理的细胞与未经任何处理的对照组比较，无显著差异(P＞0.1)(附表)。与我们对P2z受体激活剂能力顺序研究一致^［3］。

附表　ATP及其同分异构体和其它核苷作用于P2z⁺细胞后DNA末端标记结果(例数=6,±s)

　　5　OxATP的抑制效应　将P2z⁺细胞用P2z受体不可逆抑制剂OxATP^［8］(0，0.15，0.30，0.60和1.20mmol/L)作用60分钟，洗2次，再与1.0mmol/L ATP培养8小时。TdT法测定结果表明，OxATP对ATP诱导DNA降解的抑制率分别为11%、38%、65%和97%，1小时DNA标记量分别是43417, 38934, 27317, 15584，1629min^-1*μg^-1 DNA；然而，在单独使用1.2mmol/L OxATP处理细胞时，DNA末端标记量与对照无显著差别(P＞0.2)，结果同电镜、DNA凝胶电泳的观察一致。

　　6　KN-62抑制效应　P2z⁺细胞分别与0.01， 0.05，0.10，0.50，1.00，2.00μmol/L KN-62 在37℃条件下作用15分钟，再与1.0mmol/L ATP孵育8小时。TdT法定量结果显示，KN-62对ATP经P2z受体诱导DNA降解的抑制率在0.1μmol/L时为35%，在2.0μmol/L时达97%；而单纯KN-62(2.0μmol/L)对同样细胞不具毒性作用。

讨论

　　细胞凋亡或程序性细胞死亡，是细胞主动死亡过程。电镜观察与电泳检测梯形DNA是目前鉴定细胞凋亡最特异的指标^［6，7］。我们发现P2z受体在CLL细胞能介导由ATP诱导的细胞凋亡并出现其特征性变化；P2z受体的抑制剂可特异阻断经P2z受体介导的细胞凋亡发生；参与P2z受体介导细胞凋亡的激活剂与激活P2z受体的激活剂完全一致^［3］。证实了P2z受体在介导细胞凋亡过程中具有特殊作用。

　　近来的研究表明，嘌呤能受体可分为3类，即：P2y、P2x和P2z，它们各有不同的激活剂与抑制剂，分布与功能也各异^［1］。其中P2y受体主要通过与UTP、ATP结合，引起磷酸肌醇信号系统的激活，形成肌醇、磷酸，同时引起细胞内钙的释放^［1］。而对P2z受体的研究尚在起步，我们的研究表明，P2z受体是一种可与配体结合形成的阳离子通道，其激活剂与抑制剂同P2y和P2x显著不同，在造血与免疫系统起源细胞，尤其是在部分CLL细胞上呈唯一表达，这对其功能的研究无疑具有独特优点^［2，3］。有研究显示ATP可通过大鼠巨噬细胞、胸腺细胞的P2z受体引起细胞死亡^［9］，与本实验结果一致，这不仅对P2z受体而且对表达P2z受体的CLL治疗的研究将起到积极的推动作用。

　　ATP经P2z受体诱导细胞凋亡的机制仍不清楚。Tokumitsu等^［10］发现钙调节蛋白激酶抑制剂KN-62对P2z受体介导细胞凋亡有抑制效应，提示钙调节蛋白可能参与该细胞凋亡的发生。我们的实验还表明当温度＜10℃时，细胞凋亡的诱导作用将完全消失；另外，1.0mmol/L Zn^2＋(ZnSO₄）可完全抑制经P2z受体介导的细胞凋亡，表明ATP通过P2z受体诱导的细胞凋亡可能与核酸酶等酶的参与有关，其机制尚待阐明。

参 考 文 献

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　　10　Tokumitsu H, Chijiwa T, Hagiwara M, et al. KN-62，1-［N，O-bis(5-isoquinolinesulfonyl)-N methy-L-tyrosyl］-4-phenylpiperazine, a specific inhibitor of Ca^2＋/Calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ. J Biol Chem, 1990, 265:4315-4320.

(收稿：1997-07-07　　修回：1998-02-09)

(校对：徐丽娟)