急性髓性白血病细胞CD87表达及其意义

中华儿科杂志 1999年第6期第37卷 论著

作者：王津媛　白霞　王爱青　陆长明　阮长耿 徐杰　柴忆欢　奚晓东　李祯萍

单位：215003 苏州医学院附属儿童医院（徐杰、柴忆欢、李祯萍、王津媛）；苏州医学院血栓与止血研究室（奚晓东、白霞、王爱青、陆长明、阮长耿）

关键词：受体，细胞表面；白血病，粒细胞，急性；流式细胞术

　　【摘要】　目的　探讨小儿急性髓性白血病细胞尿激酶受体(uPAR, CD87)表达及其临床意义。方法　应用流式细胞术(FCM)检测了54例急性髓性白血病(AML)及20例急性淋巴细胞白血病(ALL)患儿CD87的表达，还用FCM及逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测了U937、HL-60、K562细胞在氟波酯(PMA)作用下诱导分化过程中CD87表达的改变。结果　54例AML中33例（61%）CD87为阳性表达，20例ALL均为阴性表达。CD87阳性组与阴性组AML发生髓外浸润的比例分别为88%和19%(P＜0.001)；外周血幼稚细胞百分率分别为（61.0±21.5）%和（30.5±15.2）%(P＜0.001)；完全缓解（CR）率分别为52%和86%(P＜0.05)；发生出血的比例分别为73%和62%(P＞0.05)。U937、HL-60、K562经PMA诱导分化后，CD87表达增高。结论　CD87可作为白血病诊断、分型、判断预后的指标之一，也可作为诱导分化的指标之一。

　　The expression and the clinical implication of CD87 on acute myeloid leukemia cells in children　XU Jie, CHAI Yihuan, XI Xiaodong, et al. Children′s Hospital, Suzhou Medical College, Suzhou 215003

　　【Abstract】　Objective　To explore the expression of receptor for urokinase (CD87) on acute myeloid leukemia (AML) cells in children and its clinical implication.Methods　The expression of CD87 was detected with flow cytometry (FCM) in 54 AML patients and 20 acute lymphoblastic leukemia (ALL) patients. The expressionsa of CD87 on U 937, HL-60 and K562 cells were also studied with FCM and reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) during differentiation induced by phorbol myristate acetate (PMA) in vitro.Results　The staining for CD87 was positive in 33 of 54 patients with AML (61%) and negative in 20 patients with ALL. In CD87 positive and negative groups of AML, the percentages of infiltration of extramedullary tissues were 88% and 19% (P＜0.001), respectively. The percentages of blast cells in peripheral white blood cells were（61.0±21.5）% and（30.5±15.2）% (P＜0.001), respectively. The complete remission rates were 52% and 86% (P＜0.05), respectively. The percentages of bleeding tendency were 73% and 62% (P＞0.05), respectively. The CD87 expressions on U937, HL-60 and K562 cells were increasing during differentiation induced by PMA.Conclusion　CD87 might be used as one of the markers for leukemia diagnosis, typing and prognosis, and also for myeloid leukemia cells differentiation.

　　【Key words】　Receptors, cell surface　　Leukemia, myelocytic, acute　　Flow wtometry

　　许多恶性肿瘤细胞尿激酶受体(urokinase receptor, uPAR ,CD87)表达增高，并参与其浸润、转移等过程。进一步研究表明，CD87还参与肿瘤细胞的增殖、分化、信号传导等^［1］。既往肿瘤CD87的研究多局限于实体瘤，但近几年来的研究表明，在部分白血病细胞也有CD87的表达^［2］。其意义有待于进一步研究。我们用流式细胞术检测了54例小儿急性髓性白血病细胞(acute myeloid leukemia, AML)CD87的表达，并报道了CD87表达与临床表现及预后的关系。另外，还检测了不同的白血病细胞株在诱导分化过程中CD87表达的改变。

　　对象及方法

　　一、对象

　　54例AML及20例急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)均为本院确诊的初治患儿。男42例，女32例；年龄5个月～14岁，其中M₁ 6例，M₂ 27例，M₃ 10例，M₄ 4例，M₅ 6例，M₆ 1例；L₁ 15例，L₂ 4例，L₃ 1例。

　　二、主要试剂和材料

　　CD87单抗为America Diagnostic公司产品。淋巴细胞分离液为上海试剂二厂产品。异硫氰酸荧光素标记羊抗鼠单抗(FITC-GAM IgG)为邦定公司产品。RPMI-1640及逆转录酶MMLV为Gibcol公司产品。胎牛血清为杭州四季青公司产品。氟波酯(phorbol myristrate acetate, PMA)为Sigma公司产品。以无水乙醇配制成浓度为16 μmol/L的贮存液，置-20℃保存。三磷酸脱氧核苷酸(dNTPs)及DNA分子量标准购自Sangon公司，Taq酶为Boehringer Mannheim公司产品。随机6寡聚核苷酸引物及RNA酶抑制剂(RNAsin)购自华美生物工程公司。

　　三、流式细胞术检测方法

　　取骨髓血经淋巴细胞分离液，常规分离制备单个核细胞悬液，0.01 mol/L PBS洗涤，锥虫蓝活细胞计数＞95%。10%胎牛血清孵育30分钟以封闭Fc受体。以PBS调整细胞密度为2×10⁵/ml，取细胞悬液100 μl加CD87单抗20 μl（l∶50稀释），室温孵育30分钟，阴性对照加鼠IgG代替一抗，经PBS洗涤后，加FITC-GAM IgG 20 μl(1:10稀释)，室温下避光30分钟，经PBS洗涤后流式细胞仪（Coulter公司，Epics XL型）检测。每例检测5 000～10 000个细胞，阳性判断标准为荧光阳性细胞＞20%。

　　四、白血病细胞株的诱导分化

　　白血病细胞株HL-60、U937、K562细胞悬浮于RPMI-1640培养液（含15%胎牛血清），分别加入PMA终浓度为50 nmol/L，细胞起始密度为2×10⁵/ml，置37℃，5%CO₂培养箱，培养5天，分别于作用前及作用后1、3、5天，取部分细胞用流式细胞术检测其CD87表达的改变。

　　五、细胞形态观察及硝基四氮唑蓝（NBT）还原试验

　　U937、K562、HL-60细胞经PMA作用前及作用后1、3、5天后取部分培养细胞涂片，瑞氏染色，光镜下观察形态。部分培养细胞悬液加入等量0.2% NBT Hank′s液（无Ca²⁺, Mg²⁺）混匀后，37℃孵育30分钟离心制片，瑞氏染色，计数200个细胞中阳性细胞数。

　　六、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）

　　根据CD87 cDNA序列设计合成引物（由法国Genset公司合成），引物序列为：

　　引物Ⅰ：5′-CTG CTGCTGCTCCACACCTG-3′

　　引物Ⅱ：5′-ACGCCCTTCTTCACCTTCCTG-3′

　　扩增产物为450 bp，β-actin作为内参照（由中国科学院上海细胞所合成），引物序列为：

　　引物Ⅰ：5′-ACACTGTGCCCATCTACGAGGGG-3′

　　引物Ⅱ：5′-ATGATGGAGTTGAAGGTAGTTTCGTG GAT-3′

　　扩增产物为360 bp。取1×10⁶细胞经异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取总RNA，乙醇沉淀，干燥，蒸馏水溶解。测吸光度A(曾称光密度OD)260值计算RNA浓度。取1 μg RNA加0.1 μg随机6聚寡核苷酸引物，加蒸馏水至20 μl，70℃变性5分钟，再加入5×逆转录缓冲液8 μl，二硫苏糖醇（DTT，0.1 mol/L）4 μl，dNTPs（10 mmol/L）2 μl，RNAsin 50 U，逆转录酶MMLV 200 U，加蒸馏水至40 μl，混合后37℃ 45分钟，95℃ 5分钟。取逆转录产物10 μl，加10×PCR缓冲液5 μl，MgCl₂（50 mmol/L）1.5 μl，dNTPs（10 mmol/L） 1 μl，uPAR引物Ⅰ、Ⅱ各2 μl(5 μmol/L)，β-actin引物Ⅰ、Ⅱ各1μl(5 μmol/L)，Taq酶1 U，加蒸馏水至50 μl，置PTC-100 PCR扩增仪（MJ Research Inc），94℃变性5分钟，循环参数为94℃ 30秒，56℃ 30秒，72℃ 1分钟，共30个循环，最后72℃ 5分钟，取扩增产物20 μl进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，紫外线下观察并照相，照片在GS300吸光度扫描仪（Hoefer Scientific Instruments公司产品）上进行定量分析。

　　七、统计学检验

　　采用t及χ²检验。

　　结　果

　　一、临床病例CD87表达

　　54例AML中33例为阳性表达（61%）。6例M₁中2例表达阳性，27例M₂中15例(56%)为阳性表达，10例M₃中6例(60%)表达阳性，4例M₄及6例M₅皆为阳性。1例M₆及20例ALL均为阴性表达。

　　二、CD87表达与临床表现及预后的关系

　　54例AML中，CD87阳性组发生髓外浸润及外周血幼稚细胞百分率明显高于阴性组；CD87阳性组的完全缓解率明显低于阴性组；两组之间发生出血的比例无显著差异（表1）。

　　　　表1　AML患儿CD87表达与临床表现及预后的关系

　　三、白血病细胞诱导分化过程中CD87表达的改变

　　U937、HL-60、K562细胞经PMA作用5天后，NBT还原率明显增高，大部分成为贴壁细胞，形态向单核巨噬细胞转变。HL-60和K562细胞在PMA作用前及作用后1、3、5天CD87的表达分别为（20.5±4.1)%、(60.1±5.6)%、(73.3±4.5)%、(85.0±7.2)%和（36.7±6.1）%、（55.2±5.5）%、（70.5±6.3）%。U937细胞在未经PMA作用前即已有（92.5±4.2）%的阳性表达率，故作用主要表现为荧光强度的改变，其相对荧光强度作用前及作用后1、3、5天分别为（2.0±0.6）、（5.8±0.8）、（7.8±1.3）、（8.5±1.2）。

　　四、白血病细胞经PMA作用后CD87 mRNA表达的改变

　　U937细胞CD87 mRNA表达较高，HL-60及K562细胞也有少量CD87 mRNA表达，而经PMA作用后U937，HL-60及K562细胞CD87 mRNA水平均明显增高，与β-actin的比值见表2。

　　　　表2　PMA作用前后U937、HL-60、K562细胞CD87 mRNA水平(n=3)

　　讨　论

　　CD87是一高度糖基化的单链糖蛋白，分子量为50 000～65 000，由羧基端通过磷脂酰肌醇锚定形式结合于细胞膜，氨基端为uPA结合区^［3］。在血细胞CD87主要表达于成熟的粒、单核及嗜酸细胞，而在正常造血前体细胞不表达^［4］。本组54例急性髓性白血病细胞中33例（66%）CD87表达阳性，而20例急性淋巴细胞白血病均为阴性表达。Plesner等^［2］检测了27例急性髓性白血病，其中12例（44%）为阳性表达，在急淋未见CD87表达。Jardi等^［5］也曾报道表达TdT和CD2的髓系白血病细胞不表达CD87。说明CD87可作为急性白血病细胞诊断分型的指标之一。本研究CD87阳性表达率比Plesner的结果高，但经统计学处理，χ²=2.025，P＞0.05，差异无显著意义。

　　尿激酶（urokinase or urokinase-type plasminogen activator, uPA）通过CD87结合于细胞表面，激活结合于细胞表面邻近的纤溶酶原使之转变为纤溶酶。纤溶酶不仅本身可降解一些细胞外基质成分，如层素、纤维连接蛋白等。而且还可以激活其他金属蛋白酶原，以进一步降解细胞外基质。因此，CD87在细胞对组织的纤溶中起着重要的启动、定位和扩大作用，可参与组织修复、血管形成以及肿瘤浸润转移等多种生理病理过程。在成熟的粒、单核细胞CD87表达，脱离骨髓及血管，进入组织并在其中游走，从而参与炎症及免疫反应^［6］。在M₅往往有CD87的表达，而M₅往往有肝、脾、皮肤、粘膜等髓外组织浸润表现。因此，推测白血病细胞CD87表达与其脱离骨髓进入外周血循环以及对髓外组织的浸润有关。Martinez等^［7］对鼠白血病细胞株WEH I～3B的研究也证明，白血病细胞表面纤溶活性与其对细胞外基质的降解有关。但到目前为止，尚未见白血病细胞CD87表达与其临床表现及预后关系的报道。本研究结果表明，CD87表达阳性组发生髓外浸润的比例及外周血幼稚细胞数明显高于CD87表达阴性组，CD87阳性组的CR率明显低于阴性组。因此，uPAR表达与髓性白血病的临床表现，生物学特性有关。可作为判断其预后的指标之一。Frade等^［8］曾报道在急性髓性白血病血浆 uPA增高与出血倾向有关。而本结果表明，白血病细胞CD87表达与出血无明显关系。白血病细胞CD87表达而使其细胞表面纤溶活性增高，主要与其浸润能力有关。

　　CD87表达于成熟的粒、单核细胞，是髓系细胞成熟的标志。本组结果表明，U937、HL-60、K562细胞经PMA诱导分化后CD87表达增加。说明CD87可作为髓系白血病细胞诱导分化较好的指标。但是K562细胞经PMA诱导前FCM未检出CD87表达，而RT-PCR检测其mRNA有少量表达，可能是诱导前仅少量表达于胞浆内。另外，Nusrat等^［9］的研究表明在PMA诱导HL-60细胞分化过程中，uPA可促进其分化，而uPA单抗可抑制PMA的诱导分化作用。近年来较多的研究也表明CD87还参与细胞的信号传导。因此，CD87可能不仅是髓系白血病细胞诱导分化的指标，而且在诱导分化过程中可能还起着促进作用，这方面尚有待于进一步的研究。　　本课题部分由国家教委留学回国人员科研基金资助(项目编号：96-644)

　　参考文献

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（收稿：1998-03-11　修回：1998-09-04）