急性早幼粒细胞白血病全反式维甲酸治疗时IL-8及其受体表达的观察

中华血液学杂志 1998年第7期第19卷 论　　著

作者：曾慧兰　张学光　陶瑞芳　陈子兴　张毅　张威　孙爱宁　刘继明　王爱青　王玮　林宝爵

单位：215006　苏州医学院附属第一医院、江苏省血液研究所［曾慧兰(现在广州市暨南大学医学院附属第一医院　510630)、陶瑞芳、陈子兴、张威、孙爱宁、王玮、林宝爵］；苏州医学院免疫教研室(张学光、张毅、刘继明)；苏州医学院重点实验室(王爱青)

　　关键词： 白细胞介素8；受体，白细胞介素8；白血病，早幼粒细胞性，急性

　　摘要　目的：探讨白细胞介素8(IL-8)及其A型受体(IL-8RA)的表达在全反式维甲酸(ATRA)诱导治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)中的临床意义。方法：动态检测APL患者18例ATRA治疗中血浆IL-8水平(ELISA法)，取3例骨髓单个核细胞(MNC)加ATRA(10^-6mmol/L)体外诱导，流式细胞仪动态检测MNC膜IL-8RA的表达。结果：MNC加ATRA诱导72小时，上清IL-8水平明显下降，MNC膜表达IL-8RA增高；维甲酸综合征(RA-S)发生前血浆IL-8异常升高(达1010～2000ng/L)，较体温及白细胞数量变化更敏感；感染时血浆IL-6、IL-8水平均明显升高［分别为(112.34±57.31)×10³U/L，234.16±72.18ng/L］；弥散性血管内凝血(DIC)恶化时IL-8与D-二聚体异常同步上升。结论：ATRA抑制APL细胞分泌IL-8，加强IL-8RA的表达；监测IL-8水平可预测RA-S及感染发生；IL-8与D-二聚体异常同步上升提示DIC恶化趋势。

　　Expression of interleukin-8 and its receptor in acute promyelocytic leukemia under all-trans retinoic acid treatment.Zeng Huilan^*,Zhang Xueguang,Tao Ruifang,et al.^* Department of Hematology， First Affiliated Hospital,Suzhou Medical College,Suzhou 215006

　　Abstract　Objective:To evaluate the clinical significance of expression of interleukin-8(IL-8) and its type A receptor(IL-8RA) in acute promyelocytic leukemia(APL) patients under all trans-retinoic acid(ATRA) induction.Methods:Serum IL-8 level of 18 APL patients were dynamically studied(ELISA).Fresh APL cells from 3 patients were cultured with ATRA(10^-6mmol/L).Supernatant IL-8 level and IL-8RA expression on APL cells were measured by FACS.Results:In vitro,IL-8 concentrations decreased 72 hours after incubation,while IL-8RA increased.In vivo,IL-8 increased more rapidly and markedly than temperature and WBC counts did before retinoic acid syndrome(RA-S) occurred.Serum IL-6 and IL-8 levels significantly increased when the patients suffered infection,and IL-8 increased even before fever.Both IL-8 and D-dimer increased while DIC progressed.Conclusion:ATRA inhibited IL-8 secretion of APL cells while increased the expression of IL-8RA.Monitoring serum IL-8 concentrations could predict the development of RA-S and infection.Increase of both IL-8 and D-dimer concentrations suggested DIC progression.

　　Key words　Interleukin-8　　Receptor, interleukin-8　　Leukemia,promyelocytic,acute

　　全反式维甲酸(ATRA)治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)过程中，1/3～1/2患者白细胞迅速短暂上升，约23％的患者出现维甲酸综合征(RA-S)。初步发现白细胞介素8(IL-8)异常分泌可能与此有关^［1～3］，但尚未得到临床转归的验证，亦无结合相应受体的综合分析。我们拟对APL患者在ATRA体内外诱导过程IL-8及其A型受体(IL-8RA)进行动态监测，以探讨IL-8在APL并发症的发生及监测方面的意义。

病例和方法

　　1　病例来源　1995年3月～1997年3月于本院住院，经FAB分型、染色体核型及PML/RARα融合基因检测确诊的APL患者18例，男10例，女8例，平均年龄33岁(14～55岁)。

　　2　 诱导分化　治疗前新鲜抗凝骨髓经Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离单个核细胞(MNC)，调整细胞终浓度为1×10⁶/ml， 加ATRA(10^-6mmol/L)培养6天 (RPMI 1640，10％小牛血清，37℃，5％CO₂孵箱)，每日收集细胞检测膜IL-8RA表达，上清于-20℃冻存，待测IL-8。

　　3　制备血浆标本　治疗前及治疗后隔3～5天取无菌抗凝血，分离血浆，-20℃冻存待测。正常标本取自苏州中心血库健康献血员。

　　4　IL-8测定　采用酶标ELISA夹心法^［4］。IL-8标准品、IL-8单抗由日本金泽大学松岛教授赠送，兔抗rhIL-8多抗由苏州医学院免疫教研室制备。

　　5　膜IL-8RA测定　将每日收集的细胞加入抗IL-8单抗，4℃冰浴30分钟，加荧光抗体，4℃冰浴30分钟，用流式细胞仪(Epics XL型，Coulter公司，USA)检测5000～10000个细胞中的阳性细胞。

　　6　IL-6测定　采用IL-6依赖细胞株B9细胞增殖的MTT法^［5］。

　　7　D-二聚体检测　包被抗D-二聚体单抗于酶标板孔内，加待测样品和标准品，37℃孵育30分钟，加酶标记抗体，37℃孵育30分钟，加底物OPD，37℃孵育20分钟，每孔加终止剂(2mol/L H₂SO₄)50μl，492nm波长下读数。

　　8　临床治疗方法　服用ATRA(60mg/d)至骨髓象完全缓解(CR)，ATRA诱导未缓解(NR)则加用化疗。合并弥散性血管内凝血(DIC)者予肝素75mg/d维持24小时滴注，直至出血症状消失，DIC指标转阴。

　　9　统计学方法　t检验，直线回归分析。

结　　果

　　1　MNC体外培养，动态观察IL-8及IL-8RA　加ATRA培养上清液IL-8水平前3天明显下降，随后持续低水平，细胞表达IL-8RA于第3天开始增高，第4天达高峰，之后渐回复至初始水平；不加ATRA的培养上清IL-8水平于第2天逐步升高，第5天逐渐降低，细胞的IL-8RA表达于第3天骤然降至极低，且持续低水平(图1)。

　　2　血浆IL-8水平与RA-S　18例中有1例(5.5％)发生RA-S。该例，男，31岁。初始WBC 3.6×10⁹/L，骨髓原始+早幼粒细胞0.79，核型49XY,+6,+16,+21,t(15;17)，PML/RARα基因阳性(L型)，免疫表型CD₁₃(+)、CD₁₅(+)。入院时(0天)发热伴呼吸道感染，予ATRA治疗，体温逐渐降低，+8天WBC达32.5×10⁹/L，后逐渐下降，+14天突然高热，胸闷，呼吸困难，胸腔、心包出现少量积液，血浆IL-8从19ng/L骤升至1010ng/L，+20天达2000ng/L，同时WBC达50×10⁹/L,+15～+20天予地塞米松20mg/d，+20天症状消失，血浆IL-8水平骤降(图2)

1　MNC加ATRA(10^-6mmol/L）或不加ATRA培养上清IL-8水平及MNC膜表达IL-8RA的动态比较

　　3　血浆IL-8水平与DIC的转归　初诊时5例并发DIC，其中2例于第7天死亡，随病情恶化，白细胞数、血浆D-二聚体、IL-8水平的变化见图3。

　　4　血浆IL-6、IL-8水平与感染　治疗中共发生18次发热(体温高于38℃)，其中确定病原菌证据(血、痰、尿、咽拭子或口腔分泌物找到致病菌)4次，仅有临床感染症状或体征10次，不明原因4次。取这三种情况中25份标本及发热前1～3天18份标本与体温正常时比较，发热状态IL-6、IL-8均不同程度升高，病原菌阳性时升高尤甚(见附表)。

图2　例2发生RA-S前后IL-8、白细胞数、体温演变过程

附表　血浆IL-6、IL-8水平与感染的关系(±s)

　　注:P值为各状态与体温正常时比较，*P＜0.05；#P＞0.05；△P＜0.01

　　图3　2例DIC死亡患者(例9,10)IL-8、D-二聚体、白细胞数动态变化

讨　　论

　　IL-8属于CXC细胞因子超家族，除主要炎症介导趋化活性，近年发现尚可刺激骨髓造血干细胞进入外周血^［6］。初步研究发现APL细胞功能性表达高水平的IL-8，体外ATRA独特抑制APL细胞分泌IL-8，而对非APL的白血病细胞无影响^［3］；IL-8异常表达在APL高白细胞血症及病理过程中起一定作用^［1,2］。

　　Frankel等^［7］于1992年首次描述RA-S表现为发热、呼吸困难、浆膜腔积液、肾功能衰竭等，与成人呼吸窘迫综合征(ARDS)及多脏器衰竭相似，尸解见各脏器大量白血病细胞和粒细胞浸润。已发现ARDS患者的呼吸道分泌物、浆膜腔积液及多脏器功能衰竭患者的血浆IL-8水平均升高^［8］。本组中1例RA-S，随症状发生，IL-8水平骤升(达1010～2000ng/L)，经地塞米松20mg/d治疗5天，IL-6、IL-8水平骤降。由于含量增高的IL-8可能“动员”大量分化趋于成熟的细胞从骨髓向外周迁移，触发炎症后物质如超氧离子分泌，浸润各脏器，从而引发病理过程。核因子KB(NF-KB)是IL-6和IL-8基因活化转录的关键因子，糖皮质激素抑制NF-KB的P亚基与另一必需转录子结合从而阻止转录。糖皮质激素治疗显著有效、治疗后IL-8降低的事实验证了IL-8在RA-S转归中的作用。然而在感染已控制时，何以导致IL-8再度升高从而引发病理过程尚未明了。Sham等^［9］发现APL细胞经ATRA诱导，表达成熟粒细胞标志CD₁₈、CD_11b增高，对FMLP、IL-8等炎性刺激更敏感，其F-肌纤蛋白含量比正常粒细胞高2.5～3.0倍。我们的体外实验证实虽然ATRA抑制IL-8分泌，却加强IL-8RA的表达，RA-S常发生于治疗后2周左右，此时APL细胞IL-8RA表达增强，其介导的信号传导加强，对IL-8的趋化敏感性加强，说明炎症介质的释放反应可能是引发RA-S的另一因素。RA-S发生前体温变化未显示比感染时更高，白细胞数也仅在发生后达峰值(见图2)，难以预示RA-S，唯血浆IL-8急骤升高，峰值(2000ng/L)远远高于感染时水平(234.16±72.18ng/L)，可更敏感地预测其发生。

　　IL-1β、TNFα、IL-6、IL-8是主要的炎症因子。化疗后粒细胞缺乏合并感染患者血浆IL-6及IL-8均偏高，感染控制时迅速下降,而TNFα及IL-1β不甚敏感。血浆IL-8明显升高的患者常被证实发生感染^［2］。我们的结果也显示，血浆IL-6、IL-8水平与感染证据呈正相关，其中IL-8更敏感，体温未升前即呈现偏高，可作为预示感染的指标之一。另外，2例患者在死亡前IL-8均明显升高，且与DIC的敏感指标D-二聚体的含量相关，也提示DIC的恶化趋向。

参 考 文 献

　　1　Degos L,Dombret H,Chomienne C,et al. All-trans-retinoic acid as a differentiating agent in the treatment of acute promyelocytic leukemia.Blood,1995,85:2643-2653.

　　2　曾慧兰,陶瑞芳,张学光.维甲酸诱导治疗急性早幼粒细胞白血病中细胞因子表达及意义研究进展.国外医学内科学分册,1997,24:335-337.

　　3　Dubois C,Schlageter MH,de Gentile A,et al.Modulation of IL-8 and IL-1β and G-CSF secretion by all trans retinoic acid in acute promyelocytic leukemia.Leukemia,1994,8:1750-1757.

　　4　朱建昆,蒋滢,张毅,等.人IL-8酶联免疫测定法在白血病标本检测中的应用.苏州医学院学报,1996,16:778-780.

　　5　曾慧兰,陶瑞芳,张学光.全反式维甲酸治疗急性早幼粒细胞白血病血清IL-6水平的观察.中华血液学杂志,1997,18:95-96.

　　6　Laterveer L, Lindley LJD, Hamilton MS,et al.Interleukin-8 induces rapid mobilization of hematopoietic stem cells with radioprotective capacity　and long-term myelo-lymphoid repopulating ability.Blood,1995,85:2269-2275.

　　7　Frankel SR,Eardley A,Lauwers G,et al.The “retinoic acid syndrome”　in acute promyelocytic leukemia.Ann Intern Med,1992,117:292-296.

　　8　Marty C,Misset B,Tamion F,et al.Circulating interleukin-8 concentration in patients with multiple organ failure of septic and nonseptic origin.Crit Care Med,1994,22:673-678.

　　9　Sham RL,Phatak PD,Belanger KA,et al.Functional characteristics of mature granulocytes in a patient with promyelocytic leukemia treated with all-trans retinoic acid.Leuk Res,1995,19:505-511.

(收稿：1997-09-15　　修回：1998-01-05)

(校对：王叶青)