bcl-2蛋白在肝细胞肝癌发生过程中的表达及其与肝细胞凋亡变化的关系

中国普外基础与临床杂志 1999年第4期第6卷 基础与实验研究

作者：刘战培　严律南

单位：华西医科大学附属第一医院普外科(成都　610041)

　　关键词： bcl-2基因；肝细胞肝癌；凋亡

　　摘要　为探讨肝细胞肝癌发生过程中bcl-2蛋白的变化规律及与细胞凋亡变化的关系，运用TUNEL法和免疫组化方法检测石蜡保存的肝细胞肝癌组织(hepatocellular carcinoma, HCC)、肝硬变组织(liver cirrhosis,LC)和正常肝组织(normal liver, NL)中细胞凋亡发生率和bcl-2的表达。结果： 从NL、LC到HCC组织，细胞凋亡活性出现增强； bcl-2蛋白的表达逐渐下降，LC和HCC组比较，P＜0.05。结论： bcl-2的表达可能与肝细胞凋亡的抑制有关；在肝癌发生过程中，bcl-2表达下降可能是引起肝癌细胞凋亡增加的原因之一。

BCL-2 EXPRESSION IN THE HEPATOCELLULAR CARCINOGENETIC PROCESS AND ITS RELATIONSHIP WITH HEPATIC CELL APOPTOSIS

Liu Zhanpei, Yan Lnan.

　　Department of General Surgery, First Affiliated Hospital, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041

　　Abstract　To elucidate bcl-2 protein expression in hepatic carcinogenetic process and its relationship with apoptotic changes. bcl-2 protein was evaluated immunohistochemically while apoptosis was approached with terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) technique in 8 normal livers (NL), 17 liver cirrhosises (LC) and 77 hepatocellular carcinomas (HCC). The results showed that bcl-2 protein was expressed in 3 of 8 NLs(37.5%), 5 of 17 LCs(29.4%) and 7 of 77 HCCs(9.1%) with significant differences between group NL and HCC and between LC and HCC (P＜0.05). Apoptosis rates of 1.18±0.42%, 4.85±2.78%, 12.89±2.33% in NL, LC, HCC group respectively were demonstrated with significant differences among them (P＜0.01). Compared the bcl-2 expression with the apoptosis rate in this hepatocarcinogenetic process, reversed trends were presented. Conclusion: bcl-2 expression could be detected in NL, LC and HCC, and its decreasing expression was related to the inhibition attenuation of hepatocellular apoptosis in the process of hepatocarcinogenesis.

　　Key words　　bcl-2 gene　　Hepatocellular carcinoma　　Apoptosis

　　细胞凋亡是细胞死亡的一种形式，起着维持组织稳态的重要生理作用。bcl-2蛋白可以抑制细胞的凋亡。有关bcl-2蛋白在肝硬变、肝细胞肝癌发生过程中的变化规律及其作用目前少有报道。本实验分别检测了正常肝脏组织(NL)、肝硬变组织(LC)和肝细胞肝癌组织(HCC)中bcl-2蛋白的表达及凋亡细胞，旨在探讨bcl-2表达变化在肝癌发生过程中所起的作用。

　　1　材料与方法

　　1.1　标本来源及分组

　　选取我院1995年1月至1996年6月手术获得且经病理学证实的标本92例，分为：①NL组，8例，女2例，男6例，平均年龄33.5±7.7岁；其肝组织取自脑外伤死亡患者，既往体健，血清学检测乙型肝炎标记物阴性。②LC组，17例，女1例，男16例，平均年龄50.6±12.6岁；其肝组织标本取自门脉高压患者，有乙型肝炎史，肝功Child分级为A～B级，AFP阴性，术前B超检查肝脏未见占位病变，术中探查肝脏未见癌肿。③HCC组，77例，女7例，男70例，平均年龄46.5±9.0岁；肝组织取自肝癌患者手术切除标本，其中伴肝硬变者67例，占87.0%；细胞分级为高分化者17例(22.1%)，中分化者44例(57.1%)，低分化者16例(20.8%)。

　　1.2　方法

　　bcl-2的检测用ABC法，参照Bankfalvi^〔1〕法修复抗原，分别针对Ⅰ抗、Ⅱ抗及Ⅲ抗以PBS液设立空白对照。ABC试剂药盒和鼠抗人bcl-2单克隆抗体McAb 100分别购自Vectastatin和Santa Cruz公司。结果记录为染色细胞数/总肿瘤细胞数×100%，共分5级记分，即(-)：≤5%； (+)：≤25%； (+　+)：≤50%； (+　+　+)：≤75%； (+　+　+　+)： ＞75%。

　　凋亡细胞检测用TUNEL法(参照药盒说明书)，阳性对照加入DNA酶，阴性对照仅加入TUNEL溶解液；加入荧光素-AP液后以5-溴-4-氮-3-吲哚磷酸盐(BCIP)及氯化硝基四氮唑蓝(NBT)显色或速红染色。末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿嘧啶核苷酸(dUTP)缺口末端标记药盒购自Boehringer Mannheim公司。使用Mias-2000图像分析仪分析凋亡结果，在400倍光镜下观察，随机选择10个视野，将捕获图像行二值化后计数，获得各例阳性细胞数和视野总的细胞数平均值，结果计算为阳性细胞数/总细胞数×100%。

　　1.3　统计学处理

　　使用多个样本均数的单因素方差分析和多个样本率的四格表资料确切概率法。

　　2　结果

　　2.1　bcl-2表达结果

　　光镜下见，本实验所有标本的bcl-2均在胞浆表达，多表现为环绕胞核，呈密集斑点状，表现形态各组中差别不大，但着色强度有别。阴性对照均为阴性，而阳性对照显色稳定。在NL组中有3例着色阳性(37.5%)，着色强度分别为(+)，(+　+)和(+　+　+)。LC组5例着色阳性(29.4%)，1例为(+)、2例为(+　+)、2例为(+　+　+)。HCC组中7例着色阳性(9.1%)，1例低分化HCC为(+)；5例为(+　+)，其中4例为中分化HCC，1例为高分化HCC；1例高分化HCC为(+　+　+)。3组间相比，NL和LC组间差异无显著性意义，而此两组分别和HCC组比较，差异均有显著性意义(P＜0.05)。HCC组的bcl-2表达率明显下降。

　　2.2　TUNEL法检测凋亡结果

　　光镜下，以BCIP及NBT显色时，凋亡细胞着色为深紫灰色；以速红染色时，凋亡细胞显色为鲜红色。着色部位均在核内，部分胞核凝固成致密小圆球形，凋亡细胞周围见正常细胞。本实验阳性对照(以DNA酶处理组)显色良好，阴性对照组未见显色。NL组、LC组和HCC组标本均有凋亡细胞着色。图像分析结果显示： NL组的细胞凋亡率低，仅为1.2%，LC组为4.9%，HCC组为12.9%，3组间两两比较，其差异均有显著性意义(P＜0.05)，见附表。

附表　各组细胞凋亡检测结果(±s)

　　与正常肝组比较， *P＜0.05，*　*P＜0.01； 与肝硬变组比较， △P＜0.012.3　bcl-2表达与凋亡细胞发生率的比较

　　3组的bcl-2表达变化趋势从NL、LC到HCC组，呈现为由高到低的表达率，表达逐渐减少；而凋亡细胞发生率则是从NL、CL到HCC组出现由低到高逐渐增加的趋势，二者的表达过程为反向变化(见附图)。

附图　3组bcl-2表达与凋亡发生率比较

　　3　讨论

　　bcl-2与肝癌关系的研究结果目前存在较大差异。Skopelitou等^〔2〕发现正常和异常肝细胞上均未见有bcl-2表达。Zeppa等^〔3〕发现bcl-2在肝细胞肝癌中的表达率高达19%(16/84)，且在16例中14例为高分化，提示bcl-2与肝癌细胞的分化程度有关。国内王万忠等^〔4〕也发现在肝细胞肝癌患者中，bcl-2表达率为16.2%(6/37)。Hamazaki等^〔5〕用流式细胞仪检测到正常肝、慢性肝炎和肝硬变以及肝细胞肝癌中均有bcl-2的表达，分别为4.3%，0.8%和2.1%，但组间比较差异不显著。本实验发现，在正常肝脏、肝硬变肝脏及肝细胞肝癌组织中均有bcl-2的表达，其表达阳性率分别为37.5%、29.4%和9.1%，此结果与文献报道^〔2，3〕相似，且前两组与肝细胞肝癌组间比较差异有显著性意义(P＜0.05)，提示在肝硬变发展至肝细胞肝癌的过程中，可能有bcl-2蛋白的参与。bcl-2蛋白是由bcl-2原癌基因编码，位于细胞线粒体内膜的嵴上，其作用是阻断细胞凋亡，从而延长细胞的生存时间。本实验发现，bcl-2在肝细胞肝癌中表达阳性率相对于正常肝和肝硬变组织出现下调表达，表明其在肝癌组织中的表达受到抑制。

　　在大鼠实验中，凋亡的活性从正常肝、癌前病灶到肝细胞肝癌逐渐增加，而在各期，增殖细胞均较凋亡细胞多见，提示肿瘤细胞可能自身具有增加凋亡以对抗增加的增殖活性的机理^〔6〕。本实验发现在正常肝组、肝硬变组及肝细胞肝癌组中，凋亡也呈现渐增的情形，表明人肝细胞肝癌发生过程中，并未丧失凋亡活性，反而表现出凋亡活性的增加。bcl-2在此过程中，其表达率呈现渐减的趋势，与凋亡的检测结果呈现反向变化，提示bcl-2确与细胞凋亡抑制有关，其表达的下降可能是凋亡活性增强的原因。肝硬变组和肝细胞肝癌组比较时，其bcl-2的表达和凋亡发生率之间差异均有显著性意义，提示肝硬变发展成为肝细胞肝癌时凋亡的增加与bcl-2的下调表达有关。

　　本实验结果提示，在肝癌发生过程中，bcl-2表达下降可能是引起肝癌细胞凋亡增加的原因；但其下调表达引起的肝癌细胞凋亡增加对肝癌发展所起作用尚须进一步研究。

　　参考文献

　　1　Bankfalvi A, Navabi H, Bier LB, et al. Wet autoclave pretreatment for antigen retrieval in diagnostic immunohistochemistry. J Pathol, 1994; 174(3)∶223

　　2　Skopelitou A, Hadjiyannakis M, Alexopoulou V, et al. Topographical immunohistochemical expression of bcl-2 protein in human liver lesions. Anticancer Res, 1996; 16(2)∶975

　　3　Zeppa P, Benincasa G, Fulciniti F, et al. Apoptosis and cytologic differentiation in hepatocullular carcinoma on fine needle aspiration samples. Acta Cytol, 1996; 40(5)∶861

　　4　王万忠， 王维屏， 王家耀等. bcl-2蛋白在肝肿瘤组织的表达及意义. 中华肝脏病杂志， 1996； 4(4)∶207

　　5　Hamazaki K, Gochi A, Matsubara N, et al. Expression of Fas antigen and bcl-2 protein in hepatocellular carcinoma. Acta Med Okayama, 1995; 49(4)∶227

　　6　Grasl KB, Ruttkay NB, Mullauer L. Inherent increase of apoptosis in liver tumors: implication for carcinogenesis and tumor regression. Hepatology, 1997; 25(4)∶906

(1998-08-25收稿，1999-04-09修回)