三磷酸腺苷诱导人白血病细胞U937凋亡的电镜观察

解剖学报 2000年第1期第0卷 论著

作者：吕桂芝　胡颖　张志谦　林仲翔

单位：吕桂芝　胡颖　张志谦　林仲翔（北京医科大学临床肿瘤学院暨北京市肿瘤防治研究所，北京　100034）

关键词：ATP；人白血病细胞；凋亡

　　摘　要：目的　为探讨三磷酸腺苷(ATP)对人白血病细胞U937的促凋亡作用。　方法　应用ATP(0.23g/L)作用于人白血病细胞U937(human histocytic lymphoma),(1)用白细胞计数器每日计数细胞和计算抑制率；(2)用流式细胞分析仪检测ATP对U937细胞周期改变和凋亡的影响；(3)苏木精-伊红染色和电子显微镜检测凋亡小体的形成过程；(4)用苯胺黑染色检测凋亡小体的生命本性。　结果　(1)ATP对U937细胞的增殖有明显的阻抑作用，加药48h后增殖的抑制率可达43%以上；(2)ATP处理的U937细胞周期发生改变，G₁期细胞数明显增多，ATP作用24h时G₁期前出现亚二倍体峰——凋亡峰，凋亡细胞数为3.4%，作用48h时凋亡细胞数增多为22.7%；(3)ATP处理的U937细胞首先在核内染色质浓缩成半月形贴近核膜，逐渐向核膜外移动，进入胞浆内再移向质膜内外面，紧贴质膜外面再逐步脱离细胞体，进入细胞基质中，成为游离的凋亡小体。凋亡小体有双层核膜及内质网和线粒体与深染的染色质；(4)凋亡小体拒染黑色素。　结论　(1)ATP对U937细胞的增殖有明显的阻抑作用；(2)ATP诱导U937细胞凋亡；(3)ATP阻断U937细胞于G₁期，G₁期前出现凋亡峰并出现凋亡小体(4)凋亡小体是有生命的结构；(5)ATP是U937细胞凋亡的有效促进剂。

　　分类号：R733.7　文献标识码：A

　　文章编号：0529-1356(2000)01-48

ELECTRON MICROSCOPIC OBSERVATION ON ATP

　　INDUCED U937 CELLS APOPTOSIS

LÜ Gui-zhi

　　(The School of Oncology,Beijing Institute for Cancer Research,Beijing Medical University,

　　Beijing 100034，China)

　　HU Ying

　　(The School of Oncology,Beijing Institute for Cancer Research,Beijing Medical University,

　　Beijing 100034，China)

　　ZHANG Zhi-qian

　　(The School of Oncology,Beijing Institute for Cancer Research,Beijing Medical University,

　　Beijing 100034，China)

　　LIN Zhong-xiang

　　(The School of Oncology,Beijing Institute for Cancer Research,Beijing Medical University,

　　Beijing 100034，China)

　　Abstract：Objective　In order to study the effects of ATP on U937 cells (human histocytic lymphema).　Methods　Cell culture,flow cytometry,HE staining,Nigrosine staining and electron microscopy were used.　Results　(1)ATP could inhibit the proliferation of U937 cells with inhibition rate over 43% after 48hour ATP treatment; (2)ATP treated U937 cells numbers increased obviously in G₁ phase,and apoptosis peak appeared before G₁ phase,apoptotic cell number was 3.4% for 24hour,and was 22.7% for 48hour of ATP treated U937 cells;(3) Nuclear chromatin condensed into sperical masses bound cytoplasma membrane formed apoptotic bodies which is shed from membrane surface into intercellular medium;(4) Apoptotic bodies were nigrosine staining negtive.　Conclusion　ATP inhibited the proliferation and induced the apoptosis of U937 cells (human histocytic lymphoma).It blocked U937 cells in G₁ phase and formed apoptotic bodies.It was indicated that ATP would be a effective promoter of U937 cells apoptosis.

　　Key words：ATP; U937 cells; Apoptosis▲

　　细胞凋亡是生理性死亡的主要方式，在机体的生长发育及维持自身稳定中起重要作用，细胞增殖和细胞凋亡的异常是肿瘤发生的重要因素，放射线、高热、抗癌药物等能引起肿瘤细胞的凋亡^［1］，抗癌药物的疗效与细胞的凋亡有关^［2，3］，三磷酸腺苷已是临床上用于治疗心血管疾病的辅助药，我们曾报道过它对癌细胞增殖的抑制和诱导分化作用^［4～7］，本实验观察到它对人白血病细胞有促进凋亡及凋亡小体形成的作用，这对临床开辟ATP治疗癌症及阐明凋亡细胞及凋亡小体的生物学意义都有一定价值。

　　材料和方法

　　1.细胞的培养和处理

　　人白血病细胞U937(human histocytic lymphoma)接种于含12%胎牛血清的RPMI1640培养液内，置于5%CO₂孵育箱内(37℃)，实验前按不同要求处理细胞。

　　2.细胞增殖抑制实验

　　U937细胞(10⁴/ml)接种于24孔板的培养孔内，同日或隔日加入0.23g/L ATP为实验组，不加ATP的为对照组，每日换液，每日用白细胞计数器计数细胞，该实验重复3次，取3次均值，绘制生长曲线并计算抑制率。

　　3.流式细胞分析仪检测细胞周期分布和凋亡峰

　　将接种于培养瓶内的两组细胞(10⁵／ml)依ATP处理不同时间(6、12、24、48h)分别制备两组细胞悬浮液，离心5min后(1 000r／min)固定于75%酒精内，置于4℃冰箱内贮存，待进行流式分析仪分析前，经PBS洗涤2次去上清，再各用200ul PBS制成细胞悬液，置于37℃水浴中30min，然后经PBS洗2次后加入RNase(1g/L)和PI(50mg/L)于细胞团中进行DNA染色后，在EPICS-PROFILE Ⅱ细胞分析仪上检测ATP对U937细胞的周期时相分布的影响及促凋亡作用。

　　4.透射电镜样品制备

　　分别把两组细胞悬浮离心5min后(1 000r／min)去上清，把沉淀细胞固定于1%戊二醛／PBS内，放置4℃冰箱内2h，梯度酒精脱水，Epon812包埋，LKB5型超薄切片机切片，铀铅双染。透射电镜观察、摄片。

　　5.苏木精-伊红(HE)染色检测凋亡小体

　　把接种于培养瓶的细胞于ATP处理48h时，悬浮离心5min后去上清，固定于冰醋酸甲醇(3∶1)混合液中30min，干燥后用苏木精-伊红染色，脱水透明封片后在光学显微镜下检测凋亡小体的形成过程。

　　6.扫描电镜样品制备

　　分别把两组细胞盖片固定于1%戊二醛／PBS 30min，换入PBS(-)洗2次，1%锇酸固定30min，梯度酒精脱水，醋酸异戊酯置换，临界点干燥器干燥，喷金，扫描电镜观察。

　　7.苯胺黑染色检测凋亡小体的着色情况

　　把两组细胞分别滴(5滴)在载玻片上，并分别滴入0.1%苯胺黑(黑色素，nigrosine)／任格液(2滴)待5min后，镜下检查100个U937细胞及分离出的凋亡小体，其中死亡的细胞和凋亡小体，由于膜的通透性增加势必染成黑色，若细胞和凋亡小体不着色，则表明细胞和凋亡小体是有生命的。

　　结　　果

　　1.ATP对细胞增殖的抑制作用

　　ATP对U937细胞的增殖有明显的抑制作用，当ATP(0.23 g/L)作用24h时，对照组的细胞数为3.7×10⁴／ml，实验组的细胞数为2.7×10⁴／ml，增殖的抑制率为12.5%；ATP作用48h时，对照组的细胞数为4.9×10⁴／ml，实验组的细胞数为2.8×10⁴／ml，增殖的抑制率为43%，说明ATP对U937的增殖有明显的抑制作用。

　　2.ATP对U937细胞周期时相分布的影响及促凋亡作用

　　当ATP处理U937细胞24h及48h时都可见到G₁期细胞数明显增多(详见表1)，说明ATP阻断U937细胞于G₁期延缓了细胞的周期进程，抑制了增殖。

表1　ATP作用于U937细胞不同时间周期时相的变化

　　Table 1　Changes of cycle phase by ATP Induce U937

　　cells at different time

　　当ATP作用于U937细胞24h、48h时在流式细胞仪的DNA含量直方图中出现Sub-G₁峰，即凋亡峰(凋亡细胞核断裂片断和凋亡小体)，凋亡细胞数分别为3.4%和22.7%(见表2)。实验结果充分证明了ATP对U937细胞诱导凋亡作用。

表2　ATP对U937细胞凋亡的影响

　　Table 2　Effect of ATP on U937 cells apoptosis

　　3.透射电镜观察

　　在透射电镜下观察到对照组U937细胞核仁呈网状形(图1)，凋亡细胞早期核染色质浓集形成半月形环贴近核膜(图2a)逐渐向核膜外移动，进入胞浆内再移向质膜内外面，紧贴质膜外面(图3a)，再逐步脱离细胞体，进入细胞基质中(图4a)，成为游离的凋亡小体。凋亡小体有双层核膜及内质网和线粒体(图3a,4a)。

图1　U937细胞核仁呈网状类型(↑)。(TEM)×14 700

　　Fig.1　U937 cells show nucleoli,reticular(↑).(TEM)×14 700

图2　ATP处理24h的U937细胞核内染色质浓缩贴近核膜(↑)。a.(TEM)，×10 000，　b.(LM)×100

　　Fig.2　After 24h ATP treated U937 cells nuclear chromatin condensed into sperical masess keep close to margination of nuclear membrane(↑).a，(TEM)×10 000；　b,(LM)×100

图3　ATP处理 48h的U937细胞形成凋亡小体附于细胞表面(↑)，小体内含有内质网(▲)。a.(TEM)×10 400,　b.(LM)×100

　　Fig.3　After 48h ATP treated U937 cells showed apoptotic bodies keep close to membrane surface(↑) and apoptosis bidies contained endoplasmic reticulum(ER)(▲).a,(TEM)×10 400;　b,(LM)×100

图4　ATP处理 48h的U937细胞形成的凋亡小体排出细胞外(↑)，小体内含有线粒体(▲)。a.(TEM)×14 700,　b.(LM)×100

　　Fig.4　After 48h ATP treated U937 cells showed apoptotic bodies shed from cell surface(↑)and apoptosis bodies contained mitochindrial(▲).a,(TEM)×14 700;　b,(LM)×100

　　4.苏木精-伊红染色显示凋亡小体的形成过程

　　ATP作用的U937细胞经苏木精染色，在光学显微镜(LM)可观察到凋亡小体的形成过程，首先见到染色质浓缩成半月形贴近核膜(图2b),再逐步向胞浆和胞外移动，贴近胞膜，并脱离胞膜。凋亡小体的形成过程中均见深染的染色质的变化(图3b,4b)。

　　5.扫描电镜观察

　　在扫描电镜下观察到对照组U937细胞膜表面有很多皱褶和微绒毛，微绒毛顶部有膨大的泡状物(图5)，ATP处理24h后膜表面膨大的泡状物增大增多(图6)。并见到个别细胞有突出的凋亡小体贴近细胞膜表面(图7)。ATP处理48h时可见有的凋亡小体由细胞释出，在细胞本体留下痕迹，有的凋亡小体仍附于细胞膜表面(图8)，更可见到有的凋亡小体虽附于细胞表面但多数凋亡小体基本离开细胞，细胞本体解体(图9)，并可见到由细胞释出(shed)的凋亡小体(图10)。

图5　对照组U937细胞表面有很多皱褶和微绒毛，微绒毛末端有膨大的突起。(SEM)×5 000

　　Fig.5　U937 cells of control groups.(SEM)×5 000

图6　ATP处理24h的U937细胞膜表面泡状物增大增多，呈凋亡早期的起泡现象。(SEM)×6 000

　　Fig.6　After 24h ATP treated U937 cell showed bubbles increased.(SEM)×6 000

图7　ATP处理24h的U937细胞形成凋亡小体向膜外移动并贴于膜外面(↑)。(SEM)×3 900

　　Fig.7　After 24h ATP treated U937 cells apoptotic bodies keep close to membrane surface(↑).(SEM)×3 900

图8　ATP处理48h的U937细胞形成的凋亡小体附于膜外面(↑)。(SEM)×5 000

　　Fig.8　After 48h ATP treated U937 cells showed apoptotic bodies keep close to membrane surface(↑).(SEM)×5 000

图9　ATP处理48h的U937细胞形成凋亡小体释出膜外(↑)，细胞本体已凋亡。(SEM)×4 700

　　Fig.9　After 48h ATP treaded U937 cells apoptotic bodies shed from cell and an apoptotic bodies keep close to membrane surface(↑).(SEM)×4 700

图10　ATP处理48h的U937细胞释出膜外的凋亡小体(↑)。(SEM)×6 000

　　Fig.10　After 48h ATP treated U937 cells showed apoptotic bodies shed from cell(↑).(SEM)×6 000

　　6.凋亡小体拒染黑色素

　　ATP处理的细胞只有个别的细胞和小体对黑色素是着色的(死细胞膜的通透性增大，大分子黑色素得以进入细胞，因此对黑色素是着色的)，大多数细胞和小体拒染黑色素，说明该细胞和凋亡小体的膜通透性与活细胞膜的通透性相近，黑色素不能进入细胞和凋亡小体；拒染黑色素，说明小体是有生命的结构。

　　讨　　论

　　ATP诱导胸腺细胞和某些敏感的癌细胞(如鼠的P₈₁₅、rac-1等)的凋亡已有报道^［8］，本实验应用ATP作用于人白血病细胞U937，24、48h后在流式细胞仪上分别测得G₁期前出现亚2倍体峰——即凋亡峰。G₁期细胞数明显增多，说明细胞的周期改变对细胞凋亡起着重要作用^［9］。在光学显微镜和电子显微镜下，都观察到凋亡小体的形成过程，凋亡前期染色质浓缩形成半月形的团块贴近核膜，逐渐向核膜外突出进入细胞浆内，再向胞膜移动，贴近质膜，再由内面向质膜外面突出，贴在质膜外面，逐渐脱离质膜，进入细胞的基质中去，这与很多学者报道的细胞凋亡形态学变化相一致^{［10，11］}。此时细胞体出现很多空泡，随着凋亡小体释出，细胞自我解体死亡。但凋亡小体确是有结构的，染色质由双层膜围绕，胞浆内有线粒体、内质网等细胞器以及胞膜围绕，经苏木精染色，核深染，经苯胺黑染色不着色，这些现象很可能说明凋亡小体是有结构的生命体^［11］，这对于阐明细胞结构和功能有重要意义。这些结果初步表明三磷酸腺苷是人白血病细胞凋亡的有效诱导剂，为临床开辟ATP治疗白血病提供依据。■

　　基金项目：国家自然科学基金资助项目(3958005)和北京市自然科学基金资助项目(7962002)

　　作者简介：吕桂芝(1933—)，女，山东烟台人，研究员

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收稿日期：1998-10-12

　　修回日期：1999-09-02