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IL-6在诱导M1白血病细胞分化后凋亡中的作用

IL-6在诱导M1白血病细胞分化后凋亡中的作用

免疫学杂志 2000年第1期第16卷 基础免疫学

作者:张纪岩 沈倍奋 王建安 张学敏

单位:张纪岩(军事医学科学院基础医学研究所,北京 100850); 沈倍奋(军事医学科学院基础医学研究所,北京 100850); 王建安(军事医学科学院基础医学研究所,北京 100850); 张学敏(国家生物医学分析中心,北京 100850)

关键词:IL-6;M1;凋亡;Bcl-2/Bax

  摘 要:目的 探讨IL-6能否诱导M1小鼠急性髓样白血病细胞凋亡及其分子机制。方法 透射电镜观察细胞形态判断有无凋亡发生;RT-PCR及狭缝杂交分析bcl-2家族成员表达水平的改变。结果 IL-6诱导M1细胞向巨噬细胞方向分化后,M1细胞发生凋亡;bcl-2、bcl-XL在IL-6诱导下表达下调,bax表达上调。结论 IL-6诱导Bcl-2/Bax比例改变,使M1细胞分化后凋亡。

  中图分类号:R392.11  文献标识码:A

Apoptosis of M1 cells is induced by IL-6 after the cells undergo diffe-rentiation and its molecular mechanism

ZHANG Ji-yan SHEN Bei-fen WANG Jian-an

  (Institute of Basic Medical Science,Academy of Military Medical Science,Beijing 100850,China)

  ZHANG Xue-min

  (National Center of Biomedical Analysis,Beijing 100850,China)

  Abstract:Objective To investigate whether and how IL-6 can induce apoptosis of M1 myeloid leukemic cells.Methods We determined the role of IL-6 in apoptosis of M1 cells with transmission electron micrograph.We also detected the effect of IL-6 on the expression level of bcl-2 family.Results IL-6 could induce apoptosis of M1 cells after the cells underwent terminal differentiation.The molecular mechanism might be that IL-6 downregulated expression of bcl-2 and bcl-XL,but up-regulated that of bax.Conclusion IL-6 makes the ration of Bcl-2/Bax change,which results in apoptosis of M1 cells.

  Key words:IL-6;M1;apoptosis;Bcl-2/Bax▲

  IL-6一贯被看作是凋亡抑制因子,它可抑制TGF β1、某些细胞毒化合物、野生型P53诱导的急性髓系白血病细胞凋亡[1]。在IL-6依赖株中,IL-6表现出更明确的抗凋亡效应——细胞在撤去IL-6后大量凋亡,其机制可能为JAK-STATs通路激活后诱导bcl-XL表达;高水平表达外源bcl-2基因能抑制IL-6饥饿的B9骨髓瘤细胞凋亡[2]。然而,由于IL-6生物学效应的多样性与双向性,细胞也可表现出不同甚至相反的效应。IL-3与IL-6联合预处理显著增强4-HC(4-hydroperoxycyclophosphamide)诱导的HL-60细胞凋亡,其机制可能为预处理增强了4-HC所致的HL-60细胞bcl-2、c-myc基因表达下调[3]。与此一致的是,我们在以M1细胞为模型的研究中发现:10~100ng/ml rhIL-6处理4~5d后,M1细胞表现出明确的凋亡特征。由于M1细胞中野生型P53缺如,我们检测了rhIL-6处理前后bcl-2家族成员bcl-2、bax、bcl-X的表达情况,探讨M1细胞在rhIL-6处理后走向调亡的可能机制。

  1 材料和方法

  1.1 材料

  1.1.1 细胞:M1细胞由本所王嘉玺教授惠赠,培养于10%FCS-1640中,每2~4d传代1次。

  1.1.2 试剂:rhIL-6(溶于含0.1BSA的PBS中)的比活性为107U/mg,AMV逆转录酶、Taq酶、BCIP、NBT等购自Promega公司。

  1.1.3 探针及引物:含bcl-2、bax cDNA的质粒由本室保存。bcl-X引物[4]序列如下:

  P5:5’-GTGAGTGGACGGTCAGTG-3’

  P3:5’-TTGGACAATGGACTGGTTGA-3’

  1.2 方法

  1.2.1 rhIL-6对M1细胞增殖影响的检测:将M1细胞调成5×104/ml的密度,植入24孔板,每孔1ml,加0,1,10μg/ml rhIL-6各10μl(n=2),37°C孵箱培养,每日计数。

  1.2.2 墨汁吞噬试验:将不同剂量rhIL-6处理0、1、2、3、4d的M1细胞用冰冷PBS洗2次后,调细胞密度为5×105/ml,每0.1ml加入滤纸滤过的优质墨汁10μl。37°C温育30min或4h,洗去游离墨粒,甩片,Wright’s染色,油镜下计数胞浆中吞有大小墨粒5个以上的阳性细胞。

  1.2.3 DNA抽提:100ng/ml rhIL-6处理后,于不同时间(0、1、2、3、4d)各取M1细胞约106,PBS洗2次后,移入1.5ml微量离心管中,离心去上清:加0.5ml裂解液(1g/L蛋白酶K;10mmol/L Tris-C1,pH8.0;150mmol/L NaCl;10mmol/L EDTA;0.4%SDS)重悬细胞,50°C过夜,不时振摇。加等体积酚抽提几次后,乙醇沉淀。沉淀溶于100μl TE(pH8.0)中,加RNase至终浓度0.5g/L,37°C保温30min后,1.5%琼脂糖凝胶电泳,观察结果。

  1.2.4 Wright’s染色及透射电镜观察细胞形态:按常规方法进行。

  1.2.5 RNA提取及RT-PCR:采用SDS/酚法提取细胞总RNA,OD260/OD280检测RNA完整性并定量。然后按下述方法进行RT-PCR,在0.5ml微量离心管中依次加入:2.5mmol/L dNTP 2.0μl,5×RT缓冲液2.0μl,RNasin 1U,随机引物100ng,RNA 1.0μg,AMV 2U,用DEPC水补足体积至10μl。混匀,室温10min,42°C 60min,95°C 5min,骤冷。分别取反转录产物1.0μl、3.0μl作为模板,在25μl体系中(含2.5μl 10×PCR缓冲液,2.0μl 2.5mmol/L dNTP,20μmol/L P5、P3各1.0μl,Taq酶1U)扩增GAPD和bcl-X。94°C 1min、60°C 1min、72°C 1min,共35个循环,72°C延伸7min。最后取5μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。

  1.2.6 探针制备及狭缝杂交:含有bcl-2、bax cDNA的质粒经PstI、BamHI双酶切鉴定正确后,回收345bp、222bp片段,按光敏生物素试剂盒说明书进行光敏生物素标记及狭缝杂交。

  2 结果

  2.1 rhIL-6对M1细胞生长、分化的影响 rhIL-6明显抑制M1细胞增殖,使M1细胞饱和密度下降(见图1)。在生长停止的同时,M1细胞也恢复了终末分化,获得很强的墨汁吞噬能力,10~100ng/ml rhIL-6处理4d时,墨汁吞噬试验呈阳性的细胞达95%以上,且在30min内吞噬即达高峰,与4h无明显差异,表明M1向巨噬细胞方向分化(见图2)。

图1 rhIL-6对M1细胞生长的影响

  Fig1 Effect of rhIL-6 on the growth of M1 cells

  A:normal control;B:incubation with 10ng/ml rhIL-6;C:incubation with 100ng/ml rhIL-6

图2 rhIL-6对M1细胞吞噬功能的影响

  Fig2 Effect of rhIL-6 on the phagocytic activity of M1 cells(Wright’s staining,×1000)

  A:normal control;B:incubation with 100ng/ml rhIL-6 for 4d

  2.2 rhIL-6诱导M1细胞分化后凋亡 M1向巨噬细胞分化后,在rhIL-6诱导下走向凋亡。100ng/ml rhIL-6处理4d后,M1细胞Wright’s染色可见类似凋亡小体的结构(见图3)。且细胞DNA呈典型的梯状ladder(见图4)。由于DNA梯状ladder不能作为区分坏死与凋亡的特征性标志,我们又取10ng/ml、100ng/ml处理4~5d的细胞做了透射电镜观察。电镜下可见10ng/ml、100ng/ml处理4~5d时,约有10% 的细胞呈现凋亡各期的典型形态特征:染色质核膜下凝聚呈帽状、块状或月牙状,胞浆固缩,内质网扩张,胞浆空泡化——胞核及细胞外形皱缩,核裂解成质膜包绕的团块,即凋亡小体,电镜下凋亡小体的存在是确认凋亡发生最可靠的依据。对照组则没有上述特征的细胞,说明凋亡确由rhIL-6诱导产生。

图3 100ng/ml rhIL-6作用前后M1细胞的形态变化

  Fig3 Morphological changes of M1 cells induced by 100ng/ml rhIL-6

  A,C:normal control;B,D,E,F:incubation with rhIL-6 for 4d;A,B:wright’s staining(×1000);C,D,E,F:trans-mission electron micrograph

图4 100ng/ml rhIL-6作用前后M1细胞DNA的琼脂糖凝胶电泳

  Fig4 1.5% agarose gel electrophoresis of DNA samples from M1 cells treated with or without 100ng/ml rhIL-6

  2.3 凋亡的可能机制为Bcl-2/Bax比例下降 为探讨M1细胞分化后凋亡的可能机制,我们以bcl-2、bax cDNA为探针,检测了10ng/ml rhIL-6处理不同时间bcl-2、bax mRNA表达水平的改变。首先用PstI、BamH1双酶切鉴定了含bcl-2与bax cDNA的质粒,分别切出了345bp与222bp的片段,与预测相符,证实所用质粒正确。接着回收了这两个片段,按光敏生物素试剂盒说明书进行光敏生物素标记,提取细胞总RNA,进行狭缝杂交。结果表明,10ng/ml rhIL-6处理6h后,bcl-2表达即明显减低,12~24h达最大抑制;而bax的表达水平则呈上升趋势(见图5),bax表达的改变于24h时开始出现,到48h更强。

图5 狭缝杂交检测10ng/ml rhIL-6处理前后M1细胞中bcl-2、bax表达水平的改变

  Fig5 Changes of expression of bcl-2 and bax are induced by rhIL-6.

  A:Blot hybridization analysis of bcl-2 and bax expression in

  10ng/ml rhIL-6-treated M1 cells

  B:The hybridization signals were quantified by densitometry scanning

  and expressed as the ratios of bcl-2 to GAPD and bax to GAPD

  as a function of time of IL-6 treatment.

  我们还采用半定量RT-PCR的方法检测了M1细胞中,10ng/ml rhIL-6处理前后bcl-2家族另两个成员bcl-XL与bcl-Xs表达的改变。bcl-XL与bcl-Xs是同一基因的不同转录本,据报道,我们采用的引物若扩增出0.8Kb的片段,即代表bcl-XL;若扩增出0.6Kb的片段,则代表bcl-Xs。结果我们仅扩增出了0.8Kb的片段,未扩出0.6Kb的片段,说明细胞不表达bcl-Xs,而bcl-XL的表达水平在处理后明显减低(见图6)。

图6 RT-PCR检测10ng/ml rhIL-6处理前后M1细胞中bcl-X表达水平的改变

  Fig6 RT-PCR analysis of bcl-X expression in 10ng/ml rhIL-6-treated M1 cells

  1~4:GAPD;5:DL2000;6~9:bcl-X;1,6:negative control;2,7:incubation with rhIL-6 for 0d;3,8:incubation with rhIL-6 for 1d;

  4,9:incubation with rhIL-6 for 2d

  3 讨论

  bcl-2家族与凋亡密切相关,其中bcl-2、bcl-XL等家族成员为凋亡抑制基因,而bax、bcl-Xs等为凋亡促进基因。目前认为Bcl-2/Bax比例决定细胞命运;Bcl-2与Bax可形成异源二聚体,此异源二聚体表现为抗凋亡效应;但若Bax过量,Bax则形成同源二聚体,促进细胞凋亡[5]。Bcl-XL与Bcl-2相似,亦可与Bax形成异源二聚体,有很强的抗凋亡效应,而Bcl-Xs则恰好相反,它优先与Bcl-2形成二聚体,使Bax倾向于形成同源二聚体,促进凋亡[4]。从我们的结果来看,由于IL-6处理后M1细胞中bcl-2、bcl-XL表达下调,bax表达上调,而bcl-Xs在M1细胞中不表达,故Bcl-2/Bax比例下降,Bax同源二聚体增加,细胞走向凋亡。由于凋亡发生在向巨噬细胞分化后,故我们称之为“分化后凋亡”。凋亡也部分地解释了IL-6处理后M1细胞饱和密度下降的原因。

  然而我们的结果与Yonish等的报道却似乎是矛盾的。1991年,Yonish等报道在野生型P53蛋白缺失的M1细胞中表达外源P53蛋白致细胞凋亡,而IL-6可抑制野生型P53蛋白诱导的凋亡[6]。为什么IL-6在野生型P53蛋白存在时抑制凋亡发生,而在野生型P53蛋白缺如时又可诱导凋亡?其机制我们一无所知。但我们可以推测:IL-6抑制P53下游分子的表达,从而拮抗了野生型P53蛋白所致的细胞凋亡;在野生型P53缺如的情况下,这种拮抗效应体现不出来,而IL-6对bcl-2家族的影响使细胞走向凋亡。

  尽管M1细胞的凋亡机制我们还不大清楚,但IL-6诱导M1细胞生长停止、向巨噬细胞方向分化、乃至最终凋亡的意义却是明确的。深入研究IL-6对白血病细胞的生物学效应,对于探讨白血病的发病机制、研究IL-6信号转导机制及细胞分化凋亡机制都有重要意义。

  作者简介:张纪岩(1972-),女,黑龙江,博士生,主要从事细胞因子受体的研究。

  参考文献:

  [1]LOTEM J,SACHS L.Control of apoptosis in hematopoiesis and leukemia by cytokines,tumor suppressor and oncogenes [J].Leukemia,1996,10(6):925~931.

  [2] HIRANO T,NAKAJIMA K,HIBI M.Signaling mechanism through gp 130:a model of the cytokine system [J].Cytokine & Growth Factor Rev,1997,8(4):241~252.

  [3] BULLOCK G,TANG C,TOURKINA E,et al.Effect of combined treatment with interleukin-3 and interleukin-6 on 4-hydroperoxycyclo-phosphamide-induced programmed cell death or apoptosis in human myeloid leukemia [J].Exp Hematol,1993,21:1640~1647.

  [4] BOISE LH,GONZALEZ-GARCIA M,POSTEMA CE,et al.Bcl-X,a bcl-2-related gene that functions as a dominant regulator of apoptotic cell death [J].Cell,1993;74:597~608.

  [5] OLTVAI ZN,MILLIMAN CL,KORSMEYER SJ,et al.Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog,Bax,that accelerates programmed cell death [J].Cell,1993,74:609~620.

  [6] YONISH-RONACH E,RESNIZKY D,LOTEM J,et al.Wild-type p53 induces apoptosis of myeloid leukemic cells that is inhibited by interlukin-6 [J].Nature,1991,352:345~347.

收稿日期:1999-03-16

修回日期:1999-09-30


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