IL-3、G-CSF拮抗Ara-c诱导的白血病细胞凋亡的研究

中国免疫学杂志 1999年第5期第15卷 肿瘤免疫学

作者：俞　康　吴建波　沈志坚　胡晓霞　郭守芳

单位：俞　康　吴建波　沈志坚　胡晓霞　(温州医学院附属第一医院血液学研究室，温州　325000)；郭守芳　(吉林省中医中药研究院，长春130021)

关键词：凋亡；白细胞介素3；粒细胞集落刺激因子

　　摘　要　目的：研究不同Ara-c浓度时白血病细胞凋亡的情况和G-CSF、IL-3+G-CSF对其的拮抗作用。方法：分别用不同剂量Ara-c诱导白血病细胞凋亡，同时加G-CSF、IL-3+G-CSF作为拮抗剂，分G-CSF、IL-3+G-CSF、Ara-c三组。通过形态学、DNA电泳、蛋白电泳免疫印迹法观察白血病细胞的凋亡情况。结果：随着Ara-c剂量的增加，凋亡细胞数增高。G-CSF能拮抗低剂量及常规剂量Ara-c诱导的凋亡，但不能完全拮抗中剂量Ara-c，而IL-3+G-CSF能拮抗中剂量Ara-c。Bcl-2表达蛋白IL-3+G-CSF组高于G-CSF组，G-CSF组高于Ara-c组。结论：IL-3、G-CSF能拮抗Ara-c诱导的白血病细胞凋亡。调节Bcl-2基因的表达是细胞因子拮抗凋亡的机制之一。临床应合理、适时地使用细胞因子。

　　中国图书分类号　R733.702　R331.1

The inhibitory effect of IL-3, G-CSF on

　　the apoptosis of leukemia cell induced by Ara-c

YU Kang, WU Jian-Bo, SHEN Zhi-Jian et al.

　　Department of Hematology of the First Hospital Wenzhou Medical College, Wenzhou 325000

　　Abstract　Objective: To study apoptosis of leukemia cell under vary concentratin of Ara-c and the inhibitory effect of G-CSF,IL-3+G-CSF.Methods: Observed the number of apoptotic cell in leukemia induced by vary concentration of Ara-c in morphology, DNA electrophoresis, immunoblotting. There were three groups: Ara-c, G-CSF and IL-3+G-CSF.Results: The number of apoptotic cell was increased while the dose of Ara-c araised. CSF can inhibit apoptosis by low and regular dose Ara-c, but can not complete inhibit the middle dose Ara-c. IL-3+G-CSF can do it. The protein expressed by Bcl-2 in IL-3+G-CSF group is higher than that in G-CSF group, G-CSF group is lower than Ara-c group.Conclusion: This indicate that IL-3, G-CSF can inhibit apoptosis of leukemia cell induced by Ara-c and regulation of Bcl-2 gene expression is the one of mechanism of cytokine inhibiting apoptosis. The results suggest that cytokine be used reasonably and timely in order to gain more effective chemical treatment.

　　Key words　Apoptosis　IL-3　G-CSF

　　阿糖胞苷(Ara-c)是在髓细胞白血病化疗中广为使用的抗代谢药物，近年研究表明，作用于核酸代谢不同环节的药物均能诱导肿瘤细胞的凋亡，凋亡亦是抗肿瘤药物杀灭肿瘤细胞的重要机制之一，而促细胞生长因子包括白介素3(IL-3)、粒细胞集落生长因子(G-CSF)均有明显抑制凋亡的作用。为探讨更合理地应用化疗药物及细胞生长因子，本文研究了不同浓度的Ara-c诱导新鲜白血病细胞的凋亡及IL-3、G-CSF对凋亡的拮抗作用。

　　1　材料与方法

　　1.1　研究对象　选择经骨髓形态学及组织化学、免疫组织化学分型(按白血病国内诊断标准)确诊的未治疗者，M₁ 2例、M₂ 10例、M₃ 4例、M₄ 14例、M₅ 4例。

　　1.2　实验方法　取肝素抗凝骨髓5 ml，用Ficoll(上海试剂二厂)分离单个核细胞，用15%FCS(华美产品)、RPMI 1640培养液(GIBCO产品)调整细胞浓度为1×10⁷ ml^-1，置24孔培养板(丹麦NUNCLON)中。用RPMI 1640配制Ara-c溶液(上海联华制药厂)，加入Ara-c组培养孔中，使各孔终浓度分别为10、100、1 000 μg／ml。IL-3+G-CSF组和G-CSF组则再加IL-3(上海源东产品)，使其终浓度为1×10⁴ U／ml。Ara-c组加入等量的RPMI 1640，37℃ 5%CO₂培养24 h。

　　形态学观察：收集培养细胞，离心涂片，Wright-Giemsa染色光镜下观察计数300个细胞，发现有核固缩、染色体凝聚和凋亡小体形成等特征，为凋亡细胞，并计算百分率。

　　细胞DNA电泳：分别收集各组含100 μg/ml Ara-c 孔的细胞。PBS洗涤2次，用Sep Genen DNA提取试剂盒(Promega产品)提取DNA。紫外分光光度计定量后，取样与加样缓冲液混合后，10%聚丙烯凝胶电泳，银染观察。

　　蛋白印迹免疫检测：分别收集各组含100 μg/ml Ara-c孔的细胞。PBS洗 3 次，用1 ml细胞溶解液溶解(2%SDS，0.15 mol/L NaCl， 10 μmol Tris，1 mmol/L EDTA)4℃ 30 min，用总蛋白测定试剂盒(Sigma)分光光度计测定含量，每份取50 μg，煮沸变性于10% SDS-PAGE电泳，电泳后电转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，并用封闭液(1%脱脂奶粉，0.01%Antifoam A， 0.02%叠氮钠)封闭2 h后，与Bcl-2单抗(1∶100，DoKo)孵育3 h，PBS洗3次，每次10 min，加入二抗为HRP-抗鼠IgG抗体(1∶1 000，华美产品)，室温下轻轻振荡1 h，缓冲液(150 mmol/L NaCl，50 mmol/L TrisCl，pH7.5)洗　3　次。用二氨基联苯胺(DAB)显色。

　　2　结果

　　2.1　凋亡细胞形态学观察　见表1。Ara-c组随Ara-c浓度升高，凋亡细胞增多，1 000 μg/ml时凋亡细胞达(45+6.2)%。G-CSF能拮抗低剂量Ara-c诱导的凋亡，但不能完全拮抗中剂量Ara-c诱导的凋亡。IL-3+G-CSF能拮抗中剂量Ara-c诱导的凋亡。

　　2.2　DNA凝胶电泳　Ara-c组(100 μg/ml)34例均发生DNA断裂，形成以200 bp左右为最小单位的典型DNA“梯形”图像。G-CSF组34例仅17例见到DNA“梯形”电泳图像，明显少于Ara-c组。IL-3+G-CSF组34例中9例见到较典型DNA“梯形”图像，明显低于前两组，见图1。对照组34例中未见DNA“梯形”图像。

图1　Ara-c诱导的白血病细胞凋亡

　　Fig.1　The apoptosis of leukemia cell induced by Ara-c

　　Note:1.DNA marker;2.Ara-c(100 μg/ml);3.G-CSF+Ara-c;4.IL-3+G-CSF+Ara-c

　　2.3　Bcl-2基因表达　对照组32例出现深棕色的Bcl-2表达蛋白带。Ara-c组19例存在染色变浅的表达蛋白带。G-CSF组26例出现Bcl-2表达蛋白带，其中大部分染色变浅。IL-3+G-CSF组24例存在Bcl-2表达蛋白带，表现同G-CSF组，见图2。

图2　蛋白印迹免疫法显示Bcl-2表达

　　Fig.2　The expression of Bcl-2 by immunoblotting

　　Note:A：1,3.control group;2.Ara-c(100 μg/ml);4.G-CSF+Ara-c;5,6.IL-3+G-CSF+Ara-c；B：the content of β-actin as control

表1　IL-3、G-CSF拮抗Ara-c诱导细胞凋亡率

　　Tab.1　IL-3，G-CSF inhibit the rate of cell apoptosis induced by Ara-c

　　3　讨论　　近几年研究证明抗肿瘤化疗药物、肿瘤诱导分化剂、某些细胞因子等均可诱导某些种类的肿瘤细胞凋亡，从而发挥治疗作用。本文选用髓性白血病化疗中应用最为广泛的Ara-c作为凋亡诱导剂，并以10、100、1 000 μg/ml分别代表小剂量、常规剂量、中剂量Ara-c^［1］，发现随Ara-c的浓度增高，凋亡细胞也随之增加。凋亡是Ara-c杀伤肿瘤细胞的重要机制之一，Ara-c杀灭肿瘤也不仅限于S期。化疗诱导的凋亡可能与其下调C-myc、Bcl-2的表达有关。Keith等发现Ara-c耐药白血病细胞株具有Bcl-2的高表达^［2］。用反义寡核苷酸处理该细胞后，对Ara-c的敏感性明显增加，细胞增殖被抑制，细胞凋亡明显增多。本文也观察到在常规剂量Ara-c时Bcl-2基因蛋白表达明显减少，因此说明Ara-c诱导凋亡肯定与Bcl-2基因蛋白表达下调有关。是否如文献中报道的，有激活促凋亡基因Bax使其表达增加或减少Bcl-2基因蛋白与Bax蛋白结合形成异二聚体，减轻了Bax的促凋亡作用^［3］，我们尚未作该方面的深入研究。IL-3又称多集落刺激因子(Multi-CSF)，具有作用的靶细胞起源早、范围广等特点。IL-3与G-CSF、GM-CSF及EPO之间有协同作用。有人报道在IL-3与G-CSF的协同作用下，G-CFU集落形成显著增多。G-CSF、GM-CSF、IL-3等造血刺激因子能为白血病细胞提供生长刺激信号、拮抗细胞凋亡^［4］。该拮抗作用与上调Bcl-2基因表达增强抗药能力有关。本文也观察到G-CSF有拮抗Ara-c诱导白血病细胞凋亡作用，但不能完全拮抗中剂量Ara-c诱导的凋亡。而IL-3与G-CSF的协同作用基本能拮抗中剂量Ara-c诱导的凋亡。同时也观察到G-CSF及IL-3+G-CSF均能明显使Bcl-2基因蛋白表达增加，而抑制了凋亡的发生，与文献报道一致。因此提示临床工作中足量使用Ara-c尤为重要。在条件许可下尽量使用较大剂量Ara-c，能提高化疗的疗效。同时提醒，适量、适时、慎重使用各种细胞刺激因子与化疗的成败有一定的关系。

　　作者简介：俞　康，男，36岁，副主任医师，副教授，主要从事实验血液学和临床血液学工作

　　4　参考文献

　　[1]　达万明.体外快速测定急性白血病细胞药物敏感性的初步报告.中华内科杂志，1982; 21（2）：109

　　[2]　Keith F J,Bradbung D A,Zhu Y M et al. Inhibition of bcl-2 with antisense oligonucleotides induces apoptosis and increase the sensitivity of AML blasts to Ara-c.Leukemia，1995；8:131

　　[3]　Hanada M,Aime-sempe C,Sato T et al. Structure function analysis of bcl-2 protein identification of conserved domains important for homodimerization with bcl-2 and heterodimerization with Bax. J Biol Chem，1995；270:11962

　　[4]　杨开颜，俞　康，沈志坚 et al.GM-CSF对TNF诱导白血病细胞凋亡的抑制作用.上海免疫学杂志，1997；17（3）：182

〔收稿1998-08-21　修回1998-11-16〕