原发性肝癌患者外周血中甲胎蛋白mRNA的意义

世界华人消化杂志 1999年第2期第0卷 专家述评

作者：邬光惠　陈乃玲　范公忍　田惠英　熊锦华　黄耀煊

单位：北京军区总医院解放军肝病研究所　北京市　100700

关键词：肝肿瘤；甲胎蛋白/血液；RNA，信使/分析；肝炎，乙型；肝硬化

　　中国图书资料分类号　R735.7

　　摘　要

　　目的　由于PCR技术的应用，血循环中癌细胞的检测近有很大进展. 本文用RT-PCR检测肝癌(HCC)和其他慢性肝病患者外周血中AFP mRNA，藉以反映HCC细胞的存在，并与其他血清标记物比较.

　　方法　HCC患者22例，肝硬变和慢性乙型肝炎患者各10例，健康成人受试者(对照)5例. 取患者和对照的外周血，分离单核细胞，提取总RNA并作电泳鉴定，用合成的两对引物进行巢式RT-PCR扩增AFP mRNA，同时分析血清AFP和乙肝标记物.

　　结果　AFP mRNA在13例HCC(59.1%)，2例肝硬变(20.0%)患者外周血中测到，其余标本均为阴性. AFP mRNA阳性的13例患者肿瘤均大于5cm，为晚期患者. 在该13例患者中仅有6例(46.1%)在血清中测到AFP，但有12例(92.3%)HBsAg，抗HBe，抗HBc全阳性，而AFP mRNA阴性的5例该3标记物全阴性.

　　结论　RT-PCR扩增AFP mRNA是检测HCC和肝硬变患者循环肝癌细胞的敏感方法. 患者外周血中的AFP mRNA有可能作为肿瘤转移和复发的标记对HCC诊断、随访观察和疗效评定有较大临床意义.

Clinical significance of peripheral

　　hepatocellular carcinoma

WU Guang-Hui, CHEN Nai-Ling, FAN Gong-Ren, TIAN Hui-Ying, XIONG Jin-Hua and HUANG Yao-Xuan

　　Institute of Hepatology, Chinese PLA General Hospital of Beijing Command Area, Beijing 100700, China

　　Subject headings　liver neoplasms; hepatitis B; liver cirrhosis; α-fetoprotein/blood; mRNA/analysis

　　Abstract

　　METHODS　Peripheral blood samples were obtained from 22 patients with HCC, 10 with liver cirrhosis, 10with chronic hepatitis B and 6 healthy volunteers. Total RNA was extracted from blood mononuclear cells and AFP mRNA was amplified from total RNA by nested RT-PCR.

　　RESULTS　AFP mRNA in peripheral blood was positive in 13 of 22 patients with HCC (59.1%), 2 of 10 patients with cirrhosis (20.0%) and it was negative in 10 patients with chronic hepatitis B and 6 healthy volunteers. The tumor size of all the AFP mRNA positive HCC patients was larger than 5cm, and the serum AFP positive rate was only 46.2%. In addition, the three serological indicators for hepatitis B (HBsAg, anti-HBe and anti-HBc) were positive in 12of 13patients showing AFP mRNA positive, but not in the blood of 5 AFP mRNA negative patients.

　　CONCLUSION　RT-PCR is a sensitive method for detecting circulating HCC cells and AFP mRNA in peripheral blood may be a marker for tumor cell metastasis and tumor recurrence in patients with HCC.

　　0　引言

　　肝癌(HCC)诊断目前常用的血清标记物仍为甲胎蛋白(AFP)，但不很理想，除了敏感性和特异性不是很高外，更重要的是它不能反映肝癌有无转移，而及早发现微小转移灶对于HCC治疗具有重要意义. 近来国外研究者用高敏感的反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术寻查肿瘤患者血循环中的癌细胞^［1］，有报道HCC患者用此法扩增AFP mRNA以反映血循环中HCC细胞的存在^［2，3］. 我们用巢式RT-PCR检测HCC患者外周血中AFP mRNA并与其他慢性肝病以及不同乙型肝炎标记物进行比较.

　　1　材料和方法

　　1.1　材料　住院HCC患者22例，男20例，女2例，年龄43岁～53岁；肝硬变患者10例，男7例，女3例，年龄20岁～68岁，慢性乙型肝炎患者10例，男8例，女2例，年龄26岁～55岁. 健康成人5例作为正常对照.

　　1.2　方法　①外周血单核细胞(PBMC)分离：患者抗凝外周血用常规淋巴细胞分离液，密度离心取得PBMC层，用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤离心2次，收集PBMC冻存于-80℃或液氮中，备用. ②提取PBMC中的总RNA：采用Chomczynski Sacchi法，用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取总RNA，经进一步纯化后溶于DEPC处理过的水中. ③cDNA合成：总RNA经甲醛琼脂糖凝胶电泳鉴定后进行AFP cDNA合成. 反应溶液中含1μg OligodT, dNTP 1mmol/L， RNasin 20U 和MLV逆转录酶200U，总体积为20μL，在42℃保温反应60min. ④巢式RT-PCR：上述cDNA合成的反应产物取5μL进行第一轮PCR. 反应混合物中含一对外引物20pmol/L，dNTP 200μmol/L Taq DNA聚合酶1U及相应缓冲液，总体积50μL. 在PCR仪(中国科学院产)上93℃ 45s, 54℃ 45s, 72℃ 60s，循环35次，最后在72℃继续反应7min后放4℃冷却. 取此第一轮PCR产物5μL进行第二轮PCR，用的是一对内引物12.5pmol/L，dNTP 200μmol/L Taq DNA聚合酶1U. PCR循环参数同前，最后在72℃反应7min，放4℃冷却. 引物序列：

　　外引物：5’TCAGTGAGGACAAACTATTGG　(1435-1456)

　　5’CTCTTCAGCAAAGCAGACTTC　(1809-1830)

　　内引物：5’GCTGACATTATTATCGGACAC　(1473-1494)

　　5’AGCCTCAAGTTGTTCCTCTGT　(1734-1755)

　　RT-PCR扩增产物鉴定：取第二轮PCR扩增产物进行20g/L琼脂糖凝胶电泳分析，溴化乙锭染色，在UV下观察，AFP mRNA阳性的标本可在282bp处见有DNA片段区带. 血清AFP检测：用上海亿康生物化学工程有限公司产的AFP ELISA试剂盒.

　　2　结果

　　2.1　HCC患者PBMC AFP mRNA　HCC患者22例的PBMC总RNA用AFP mRNA引物作巢式RT-PCR，扩增产物电泳分析证明22例中有13例(59.1%)在相当282bp位置观察到DNA区带，电泳图谱见图1. 在22例HCC患者中20例肿瘤＞5cm，2例肿瘤＜5cm. AFP mRNA呈阳性的13例患者肿瘤均＞5cm，为Ⅲ～Ⅳ期HCC患者(表1). 在上述22例HCC患者PBMC AFP mRNA阳性的13例中只有6例(46.1%)在其血清中测到AFP. 本组22例HCC患者均感染过HBV，其中HBsAg阳性的14例中有9例测到AFP mRNA(64.2%),HBsAg阴性的8例中只有4例测到(50.0%). 此外在检测结果中发现有12例患者血中HBsAg，抗HBe和抗HBc三种标记物全阳性，AFP mRNA亦全阳性，另有5例上述3种标记物全阴性，AFP mRNA亦全阴性(表2)，提示AFP mRNA的表达与HBV感染可能有关联.

图1　HCC患者外周血AFP mRNA RT-PCR产物电泳图谱.

　　1-3. 3例HCC患者外周血AFP mRNA RT-PCR产物　4.正常对照　5.Mr标准(pBR322-Msp-Ⅰ).

表1　HCC和慢性肝病患者PBMC AFP mRNA检测

n(%)

表2　HCC患者PBMC AFP mRNA与血清HBV标记物比较

n(%)

　　2.2　慢性肝病患者外周血中AFP mRNA　除HCC患者外我们还对肝硬变、慢性乙型肝炎患者和正常对照的外周血进行AFP mRNA检测. 结果肝硬变10例中2例阳性(20%)，慢性乙型肝炎10例和正常对照5例均为阴性.

3　讨论

　　目前手术仍然被认为是HCC有效的治疗方法，但手术后复发率甚高，这由于部分患者术前在血循环中存在有微小转移灶，术后机体抵抗力降低，血中HCC细胞得以增殖，使HCC复发和转移. 故如能在术前测出血中癌细胞，加用全身化疗，术后加强监测，观察血中癌细胞量动态变化，则不仅对肿瘤复发和预后判断有重要意义，且为指导临床治疗提供了病理生理依据，因此在临床上寻找能反映血循环中HCC细胞的标记物成为迫切需要解决的问题. 但是由于微转移的癌细胞数量少，现有的病理形态学和免疫细胞化学技术难取得结果. 近年文献上提出用RT-PCR法监测AFP mRNA外，还有清蛋白(Alb) mRNA. 人类afp基因定位于4q11-21，在胎儿肝细胞中afp基因处于激活状态，有转录水平和翻译水平的表达，出生后停止表达. 但在HCC细胞中该基因又被激活，AFP mRNA和AFP蛋白又重新表达. Matsumura et al^［2］首先报道HCC患者血中检测到AFP mRNA，认为检出它可予示肿瘤细胞的血扩散转移. 日本的其他研究小组也进行了这方面研究^［3，4］. 人类清蛋白基因亦位于第4号染色体上，在肝细胞中表达最高. 近有国外文献报道应用RT-PCR法测知外周血中有Alb mRNA存在亦可作为反映HCC转移的指标，但对此文献尚有争议，如Matsumura et al持否定意见，根据是Alb mRNA在健康者PBMC中亦能测到^［2］. 但国内近有报道此法可示HCC微转移，健康者血中无Alb mRNA^［5］. 所以关于Alb mRNA尚需进一步临床研究证实.

　　本研究RT-PCR测PBMC AFP mRNA 在22例HCC患者中阳性率为59.1%与Matsumura et al报告的接近，高于血清中AFP蛋白的阳性率. PBMC AFP mRNA阳性的HCC患者有53.9%在血清中测不到AFP，故作为标记物AFP的主要缺点是它不能反映HCC有无转移而HCC患者血中AFP mRNA检测的重要临床价值也就在此. 关于血中AFP mRNA的检出与HCC患者临床病理状态的关系，本文进行了一些观察，在血中检出AFP mRNA的HCC患者在临床分期上多属Ⅲ～Ⅳ期，3例Ⅱ期的患者则未测到. 在肿瘤大小上，AFP mRNA呈阳性的13例患者肿瘤均＞5cm，而＜5cm的两例AFP mRNA呈阴性. 从上述结果看，外周血中能测到AFP mRNA的都是晚期的HCC患者，因迄今测的早期HCC患者数量有限，对于早期HCC能否在PBMC AFP mRNA的检测中得到反映的问题，本文难于作出结论. 但我们注意到最近有一日本研究小组^［6］报道关于14例早期HCC患者PBMC AFP mRNA检测研究的结果. 患者用TAE、注射酒精等治疗，随访24mo～50mo. 在第一次治疗前AFP mRNA全阴性，治疗后4mo～32mo中有13例HCC复发，复发前即有2例显示AFP mRNA阳性，复发时共有6例阳性. 后经治疗13例中有6例肿瘤消失，AFP mRNA转阴，后来该6例中有3例第2次复发，AFP mRNA又呈阳性. 研究者认为PBMC AFP mRNA可作为早期HCC复发的标记物.

　　本结果显示血清HBsAg阳性的HCC患者PBMC AFP mRNA阳性率(55.6%)高于HBsAg阴性的患者(50.0%)，另外HBsAg，抗HBe和抗HBc测定结果阳性与否与PBMC AFP mRNA的结果有一定的一致性，提示AFP mRNA的表达与HBV感染有一定联系. 虽在慢性乙型肝炎患者外周血中未测到AFP mRNA，但肝硬变患者10例中有2例测到AFP mRNA. 就现所知HCC发生与发展主要是通过乙型肝炎-肝硬变-肝癌这一途径，HBV的x蛋白(HBx)在这中间起有重要作用. 本实验室曾报道免疫组化分析证明HCC、肝旁组织和肝硬变组织HBx有异常表达，体外实验证明HBx可与p53抑癌基因表达的P53蛋白作用^［7，8］. 所以，癌旁或肝硬变组织AFP mRNA阳性细胞可能是具有癌前性质的细胞，AFP基因的表达可先于肝癌的发生，因此检测PBMC AFP mRNA有可能作为无创伤的预测HCC发生的辅助手段.

　　致谢　本文照片为北京军区总医院摄影室熊存峰、李行忠二同志所拍，特此致谢.

　　作者简介：邬光惠，女，1934-06-20生，四川省宜宾市人，汉族. 1959年沈阳中国医科大学医疗系毕业，教授，主要从事肝病诊治分子生物学研究，发表论文50篇，参加编审《丙型肝炎》等专著4部.

　　通讯作者　黄耀煊教授，100700，北京军区总医院解放军肝病研究所，北京市东四南门仓5号.

　　Correspondence to:Prof. HUANG Yao-Xuan, Institute of Hepatology, Chinese PLA General Hospital of Beijing Command Area, 5 Nanmencang, Dongsi, Beijing 100700, China

　　Tel. +86·10·66721629 Ext. 8233

　　4　参考文献

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　　［2］ Matsumura M, Niwa Y, Kato N, Komatsu Y, Shilna S, Kawabe T. Detection of α-fetoprotein mRNA, an indicator of hematogenous spreading hepatocellular carcinoma, in the circulation: a possible predictor of metastatic hepatocellular carcinoma. Hepatology, 1994;20:1418-1425

　　［3］ Komeda T, Fukuda Y, Sando T, Kita R, Furukawa M, Nishida N. Sensitive detection of circulating hepatocellular carcinoma cells in peripheral venous blood. Cancer, 1995;75:2214-2219

　　［4］ Niwa Y, Matsumura M, Shiratori Y, Imamura M, Kato N, Shina S. Quantitation of α-fetoprotein and albumin messenger RNAs in human hepatocellular carcinoma. Hepatology, 1996;23:1384-1392

　　［5］　黄智铭，袁世珍，朱兆华，黄志明. 肝癌患者周围血白蛋白mRNA检测. 中华内科杂志，1998；37：10-13

　　［6］　Nambu S, Yata Y, Higuchi K, Watanabe A, Circulating alpha-fetoprotein mRNA and its clinical significance in human hepatocellular carcinoma in early stage. Hepatology, 1997;26(4 Pt 2):571A

　　［7］ 黄耀煊，邬光惠，吴霞，范公忍，皋岚湘，王锡育. 原发性肝细胞癌中乙型肝炎病毒x抗原表达的分析. 肝脏病杂志，1995；3：86-88

　　［8］　邬光惠，黄耀煊，李瑞平，范公忍，黄洁，陈乃玲. 原发性肝癌患者肝组织中乙型肝炎病毒x蛋白与P53蛋白的结合. 临床肝胆病杂志，1997；13：19-21

收稿日期　1998-07-06